利用相干拉曼散射成像技术对皮肤内药物化合物进行可视化与定量分析

该方法学的意义在于，它能够利用相干拉曼成像技术对局部应用的药物产品进行可重复且准确的定量分析。其他方法仅能提供整体的皮肤药代动力学信息，而该方法不仅能提供整体水平的皮肤药代动力学数据，还可获得微尺度层面的信息，例如药物的渗透途径。对渗透路径的可视化与定量分析将有助于开发针对特定途径设计、以更有效地到达靶部位的药物产品。

组织制备将是本方法学中最具挑战性的部分。组织应足够薄，以便能够透过皮肤读取文字。开始制备裸鼠耳部皮肤组织时，获取已实施安乐死的裸鼠，并使用镊子和显微外科剪刀切除鼠耳。

然后将一只耳朵放入一个60毫米×15毫米的大培养皿中。接着用PBS冲洗小鼠耳朵两次，每次用擦拭纸将耳朵吸干。如果在24小时内使用，将耳朵置于盛有PBS的小培养皿（35毫米×10毫米）中，并在2至8摄氏度保存。

收获后若需在24小时后使用，将耳组织置于不含PBS的培养皿中，用封口膜覆盖培养皿后于-20摄氏度冰箱中保存。在生物安全柜内操作时，将人皮肤组织放入较大的培养皿中，使角质层朝下，以便暴露皮下脂肪组织。随后使用镊子和显微外科剪去除皮下脂肪。

当无法再用剪刀去除皮下脂肪时，使用10号一次性解剖刀，以45度角紧贴皮肤表面，在用镊子固定皮肤的同时切除剩余的皮下脂肪。脂肪去除后，将人皮肤切成每块1厘米×1厘米的组织片。进行脂质成像时，将小鼠耳部的前侧朝下，贴向35毫米、0号玻璃底培养皿的底部放置。

对于人皮肤样本，应将皮肤的角质层朝下放置，以便从表层到深层进行药物定量分析。将组织置于玻璃底培养皿中央后，使用棉签轻轻按压，确保皮肤平整并与玻璃底表面完全接触。为防止成像过程中发生移动，将一个垫圈置于皮肤上方，并确保组织可通过垫圈中央的孔洞进行受激拉曼散射（SRS）透射检测。

用移液器将预定剂量的制剂滴加到皮肤上，然后用戴手套的手指顺时针揉搓30秒。待制剂渗透时间结束后，去除多余的制剂，再将制剂面朝向玻璃底培养皿放置皮肤。接着，启动显微镜控制（Microscope Control或MC）软件，进行实验设置。

通过目镜观察，使用调节旋钮调整轴向焦距，确保组织处于焦点范围内。完成后，解除泵浦光束和斯托克斯光束的阻断，并确认已启用ALG1和ALG2通道。确保SRS光电二极管位于聚光镜上方的正确位置，然后在MC软件中点击“Focus x2”，以在CARS和SRS通道中观察皮肤图像。

在多区域时间延时（Multi-Area Time Lapse，MATL）模块中，进入“视图”选项卡，点击“已注册点列表”，以显示成像列表。确定角质层后，通过滚动轴向焦平面（Z轴焦平面）来识别特定的组织分层。可根据脂质调谐对比度实时成像过程中所确定的结果，在皮肤内添加特定深度，如角质层、皮脂腺、脂肪细胞或皮下脂肪。

然而，如果需要获取完整的深度序列图像，则可以添加XY位置，而忽略相对Z位置。在针对每层皮肤结构成像特定深度的情况下，选择“注册点”以将其添加到MATL队列中。对于全深度序列图像，在“采集参数”窗口中点击“为每个带深度选择的XY位置注册点”。

接下来，在 MATL 模块中将重复次数设置为 1，然后点击就绪。当播放箭头从灰色变为黑色时，点击播放以开始对初步脂质层进行成像。成像循环完成后，阻断泵浦光束和斯托克斯光束，并根据目标波数或拉曼振动，在激光器图形用户界面中将波长调整至所需波长。

调整手动时间延迟阶段，同时确保用于成像脂质和活性药物成分（API）的功率与预先确定的功率相同。选定总循环重复次数后，解除泵浦光束的遮挡，并在按下“Play”开始自动成像设定点之前，使用光电二极管检查功率是否达到目标功率。接下来，通过将皮脂腺脂质图像导入 Fiji 并勾选标记为“Split channels”的复选框，将文件拆分为 CARS 和 SRS 通道，从而对每种皮肤分层进行数据分析。

要打开感兴趣区域（Region of Interest，ROI）管理器，请点击分析（Analyze）、工具（Tools），然后选择 ROI 管理器（ROI Manager）。使用 SRS 通道并将 C 设置为 1，取消图像中皮脂腺的选区标记，然后在 ROI 管理器中点击“添加 T”（Add T）将标记添加至 ROI 管理器。对图像中的每个皮脂腺重复此操作。

为了屏蔽富含脂质的区域，依次选择每个 ROI，然后点击 More（更多）、OR Combine（或组合）和 Add（添加）选项卡。为了屏蔽贫脂质区域，使用 Fiji 菜单中的矩形工具，在整幅图像周围绘制一个方形区域，并将该区域添加到 ROI Manager（ROI 管理器）中。

在 ROI 管理器中，单击新添加的方形 ROI，以及用于选择所有富含脂质区域的 ROI。在“更多”选项下，选择“异或”（XOR）以生成贫脂区域的掩膜，并将其添加到 ROI 管理器中。依次转到图像、堆栈、工具，然后按数值顺序连接图像。

或者，通过在Fiji中加载一幅图像，然后在设置页面选择名为“将文件名相似的文件分组”的选项来导入图像。在拼接图像处于激活状态时，进入ROI管理器以选择富含脂质的区域，点击“更多”选项卡，然后选择“多测量”，等待结果窗口出现。从结果窗口中将数据导出至电子表格，并添加一列标题为“区域”的列，用于为每一行数据标注对应的富含脂质的区域。

将脂质贫乏区域添加至脂质之外的区域。为可视化数据，将电子表格保存并导入 R 软件包 ggplot2 中，然后以图像编号为横坐标、平均强度为纵坐标绘制数据，以估算浓度-时间关系数据。

在 RStudio 中对从电子表格导入的强度-时间数据调用单层模型进行非房室分析（NCA）。完成后，绘制 Jmax 和 AUCflux-all 指标的图表并进行可视化比较。此外，对不同实验条件之间进行统计学比较。

代表性分析显示了来自裸鼠耳部皮肤的角质层、皮脂腺、脂肪细胞和皮下脂肪，以及来自人皮肤的角质层、乳头层真皮和一个皮脂腺。在裸鼠耳部皮肤中，观察到皮脂腺的组织移动有限，在给药时和给药后120分钟时，腺体处于相同的组织深度。而在皮肤中出现显著组织移动的情况下，给药120分钟后皮脂腺几乎不可见，表明原始方案效率低下。

在多项研究中，强度随时间变化的曲线显示初始浓度较高，随后浓度逐渐降低，表明药物未再进一步被组织吸收。另一方面，部分研究显示强度先升高，之后在实验过程中逐渐下降，表明在成像前药物向组织内的渗透通量尚未达到最大值。对同一活性药物成分（API）两种剂型的浓度-时间曲线进行非房室分析（NCA）表明，无论皮肤层次如何，相较于凝胶剂型，乙氧基-乙氧基乙醇剂型可实现更持久的API渗透。

相同配方之间的总暴露量分析在皮肤深层显示出相似的结果。在药物应用后，人皮肤的制备以及将其正确放置于玻璃底培养皿上，对实验成功至关重要。此处的澄清溶液证明了该方法的适用性。

后续研究将涉及市售剂型（如乳膏），以了解制剂对活性药物成分（API）渗透和透过的影响。