用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

我们的研究利用多模态显微镜来测量多种病理状态下分子和代谢的差异，并可视化其空间异质性。这种多模态光学成像方法使我们能够从多个角度识别病理生理变化。多模态光学显微技术的应用范围正在不断扩大，特别是在临床领域，微型内窥镜的发展为临床成像开辟了新的途径。

目前实验面临的主要挑战在于将所有硬件设备相互整合的复杂性，这也是我们采用自行搭建的显微镜系统的原因之一。通过使用我们的多模态光学成像平台，我们在无标记生物正交疾病研究方面取得了显著进展，包括对不同乳腺癌亚型的分类以及对果蝇和小鼠大脑中脂质代谢的分析。利用这种无标记的多模态光学成像技术，我们能够同时可视化代谢过程、形态结构和分子组成，为研究疾病及衰老过程提供了强有力的工具。

首先，预热激光器并等待约15至20分钟。依次打开控制箱、触摸面板控制器、主激光器遥控器的交流适配器和副激光器遥控器的交流适配器，然后打开硅光电二极管探测器和锁相放大器。设置激光系统，使其泵浦光束的波长可在780纳米至990纳米范围内调节，脉冲宽度为5至6皮秒，重复频率为80兆赫兹。

斯托克斯激光束的波长应固定为1031纳米，脉冲宽度为六皮秒，重复频率为80兆赫。确保泵浦光束和斯托克斯光束均处于低功率状态，至少20毫瓦，以便在准直板上可见。在高数值孔径油浸聚光镜上涂抹浸油。

将显微镜载玻片安装到油浸聚光镜上，并在载玻片上放置一大滴水，用于25X水镜物镜观察。调节Z轴载物台，调整焦距，直至在25X水镜物镜下可见生物样本的明亮明场图像。按正确顺序开始成像过程，以避免光漂白。

在MPF和SHG之间快速切换时，需从泵浦光束切换至固定的斯托克斯光束。将图像分辨率设置为512×512像素。MPF和SHG的像素驻留时间均设为8微秒，平均帧数设为3帧以上。

对于SRS模态，使用每个像素40微秒、平均帧数为2的设置。为获取MPF的自发荧光，需关闭斯托克斯激光束。将泵浦激光器调谐至800纳米，以激发NADH和黄素。

使用SHG获取胶原纤维信号。关闭泵浦激光束，仅使用功率为500毫瓦的斯托克斯激光束。利用SRS获取蛋白质和脂质的空间分布。

保持两束激光开启，并调节激光束频率以匹配每种分子的特定振动模式。为获取受激拉曼散射（SRS）高光谱图像数据集，选择“suite”模式并将波长范围设置为781.3纳米至806.5纳米。选择不少于60层的图像层数，并采集高光谱图像堆栈。

将相同感兴趣区域的所有图像保存在同一文件夹中，并确保图像格式为 Olympus OIR 文件。自发荧光和受激拉曼散射成像成功获取了人体肺组织的代谢和结构信息。通过光学氧化还原比率和脂质不饱和度比率的比值分析，提供了人体肺组织中代谢活性和分子组成的空间分布。

对健康组织与肿瘤组织之间氧化应激水平和脂质不饱和度的定量比较揭示了其代谢状态的差异。