一种用于研究炎症过程中白细胞与内皮细胞相互作用的微生理系统

白细胞与内皮细胞的相互作用在脓毒症等炎症性疾病中起着重要作用。炎症调控失常常导致血管内皮屏障功能改变以及白细胞过度迁移，进而引发器官损伤。这种仿生微流控检测技术（我们称之为bMFA）可模拟体内微血管网络的拓扑结构和流动条件，实现实时评估中性粒细胞的滚动、牢固黏附、铺展以及向组织腔室迁移的过程。

生物模拟微流控检测的一个优势在于能够使用原代人源细胞和具有临床相关性的患者样本，从而提高临床转化能力，并快速筛选潜在的治疗药物。本次实验操作将由我实验室的研究生研究助理杨 Qingliang 先生进行演示。使用精细镊子将约一英寸长的导管插入各端口内，其中一个进口端口除外。

使用颌式夹具将两个出口端口和组织舱室夹紧在一起。用 PBS 将纤连蛋白储备液稀释至 100 微克/毫升。取 1 毫升注射器，连接 24 号钝头针，吸入稀释后的纤连蛋白溶液，并将该注射器连接到一段 4 英寸长的导管上。

将管路插入开放的进样口，推动活塞直至人纤维连接蛋白从另一个进样口流出，随即夹闭该管路。对剩余的各个进样口重复此操作，直至所有通道、组织腔室及管路均充满人纤维连接蛋白溶液。移除针头，但保留四英寸长的管路插入状态且不夹闭。

进行脱气时，将未夹紧的管路连接至与压缩氮气罐相连的气动引液装置，氮气压力为每平方英寸五磅，持续15分钟。在显微镜下检查通道或组织腔室内是否残留气泡，若发现气泡，则需重新连接装置。将装置从气动引液装置上取下，并在37摄氏度条件下孵育一小时。

使用预热的人肺微血管内皮细胞培养基，冲洗所有通道和组织腔室。按照文本稿件中所述收获内皮细胞后，以150 × g离心5分钟，使细胞沉淀。在可编程注射泵上安装一支1毫升注射器，并将管路连接至平头针。将约20微升细胞悬液吸入管路中，注意不要让液体进入注射器筒内。

从装置的出口端取下夹子。将管路连接到入口端，确保无气泡进入通道。以每分钟四至八微升的流速停止泵运行，并在显微镜下观察。

当通道充满细胞后停止泵送。夹闭出口并剪断进口管路。将装置置于含5%二氧化碳、37摄氏度的培养箱中孵育四小时。

孵育4小时后，准备另一支注射器，并用新鲜的细胞培养基填充。将注射器安装到注射泵上，并连接至入口端口。移除出口端口上的夹子。

以每分钟四到八微升的速度将新鲜培养基通过装置约五分钟，以去除悬浮或未贴壁的细胞。用新鲜的细胞培养基填充注射器，准备好后将其安装在注射泵上，并连接至一个进样口，同时保持出样口开放。

将装置置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中。按照文本手稿中的描述，设置注射泵以在流动条件下培养内皮细胞。在流动条件下培养 48 小时后，使用显微镜检查 bMFA。

共聚焦显微镜显示，血管通道的所有表面均被内皮细胞覆盖，在bMFA中形成了完整的三维管腔。制备三个不同的bMFA装置后，分别用细胞培养基、TNF-α或TNF-α联合PKC delta抑制剂装填三支1毫升注射器，其中TNF-α作为一种炎性细胞因子用于刺激内皮细胞和中性粒细胞，PKC delta抑制剂是一种新型抗炎抑制剂。

将三个已装液的注射器连接至三个bMFA装置。使用缓冲液TNF-alpha或添加了抑制剂的TNF-alpha，以每分钟0.1微升的流速处理人肺微血管内皮细胞4小时。按照文本稿件中的描述分离人中性粒细胞后，将中性粒细胞重悬于999微升HEPES缓冲液中，并向悬液中加入1微升10毫摩尔的CFDA SE染料储备液，最终获得10微摩尔的CFDA SE工作液，室温孵育10分钟。

用 HEPES 缓冲液洗涤细胞两次，每次以 315 × g 离心 5 分钟。计数细胞后，将中性粒细胞重悬于细胞培养基中，浓度为每毫升 200 万个细胞，或加入 TNF-α，或同时加入 TNF-α 和 PKC delta 抑制剂，室温孵育 15 分钟。用细胞培养基配制浓度为 1 微摩尔的趋化因子 fMLP，并将其吸入注射器中。打开 bMFA 的一个入口和一个出口端口。

从组织舱中移除端口管路，插入 fMLP 管路。向所有 bMFA 的组织舱内注入约 20 微升 fMLP，留一个使用细胞培养基处理的组织舱不加。剪断管路并用夹子夹住。

用大约 200 微升的中性粒细胞悬液重新填充注射器，并将注射器安装到注射泵上。将装置放置在倒置显微镜载物台上后，设定流速为每分钟 1 微升，并启动泵。等待中性粒细胞悬液从小段管路末端形成一小滴后，将管路插入入口端口。

荧光标记的中性粒细胞流入血管通道，并在生理相关的流动条件下与内皮细胞相互作用。实验开始10分钟后，打开图像分析软件，将物镜切换至10倍，并使用载物台操纵杆将装置居中置于显微镜下。为获得黏附图谱，进入“Acquire”菜单，点击“Scan Large Image”。

会弹出一个新窗口。选择10倍物镜，并设置视野选项，例如5乘以3。单击扫描，然后单击文件，保存黏附图谱。

为了获得用于迁移分析的迁移图谱，请使用载物台操纵杆将设备置于显微镜视野中央。点击“View”（查看）、“Acquisition Controls”（采集控制）、“ND Acquisition”（多维采集）。此时将弹出一个新窗口。

设置文件保存路径并输入文件名。勾选“大图像”功能，设置扫描区域，例如 5 乘以 3。勾选“时间”功能，将时间间隔设为五分钟，持续时间设为 60 分钟。

每隔五分钟拍摄一次组织腔室的延时图像，持续一小时。CFD 模拟显示，血管通道内的流动模式为层流，但在分流区域，流动模式受到干扰。完成仿生微流控实验后，相差显微镜图像显示，血管通道表面已被内皮细胞覆盖，并在培养 48 小时后沿剪切流方向排列整齐。

采用共聚焦显微镜进行荧光成像，结果表明内皮细胞在bMFA中形成了完整的三维管腔。获得了中性粒细胞黏附图谱，显示中性粒细胞在bMFA中与内皮细胞之间存在显著的黏附作用。bMFA中的中性粒细胞迁移图谱显示，在TNF-α激活后，大量中性粒细胞在组织腔室内发生迁移，而在未进行TNF-α激活的情况下则未观察到此类迁移现象。中性粒细胞空间分布与剪切速率相关联的黏附图谱表明，中性粒细胞的黏附主要发生在剪切速率较低的血管以及靠近分叉区域的部位。

此外，TNF-α处理显著增加了细胞黏附，而PKCδ抑制剂可抑制该效应。对延时成像结果的分析表明，TNF激活内皮细胞可增强中性粒细胞对fMLP的迁移反应，而经PKCδ抑制剂处理后，中性粒细胞的迁移能力较TNF-α处理组降低。因此，bMFA可用于评估新型抗炎治疗药物的疗效。

通过测量炎症期间的通透性、跨内皮电阻（即TEER）以及黏附分子表达等变量，bMFA还可用于研究内皮完整性。这种仿生微流控检测方法能够模拟不同器官的微环境，不仅限于单一细胞类型或物种，还可模拟对器官功能及多种疾病建模至关重要的细胞/细胞间通讯。