三维肝组织细胞培养模型中组蛋白翻译后修饰的全局定量分析

已有研究表明，全局染色质动态变化在多种疾病状态（如癌症和衰老）中发挥着重要的介导作用。我们的实验方案提供了一个符合生理相关性的模型，可用于研究这一过程。目前，实验室对组蛋白翻译后修饰（PTM）的标准分析通常局限于使用基于抗体的检测方法，每次仅能检测一种特定的PTM。

通过液相色谱-质谱联用技术分析组蛋白翻译后修饰，可使我们在单次实验中检测数百种翻译后修饰的丰度。本实验操作将由来自实验室的博士后Stephanie Stransky、研究生Ronald Cutler和研究技术员Julie Kim分别进行演示。首先，使用标准培养基将细胞以单层形式培养至80%汇合度。

然后用HBSS洗涤细胞。加入5毫升用HBSS稀释的0.05%胰蛋白酶-EDTA。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5分钟。

使用显微镜检查细胞脱落情况。计数细胞后，用新鲜培养基稀释细胞悬液。加入0.5毫升培养基，以平衡一个超低吸附的24孔圆底板，每孔内含多个微孔。

然后以3000 × g离心培养板，以去除板表面的气泡。接着将先前制备的细胞悬液转移至24孔板中，并在120 × g下离心3分钟。检查24孔板中的细胞，随后将培养板置于37°C、含5%二氧化碳的环境中孵育24小时，以形成球状体。

同时，为平衡生物反应器，向湿度室中加入 25 毫升无菌水，并向细胞室中加入 9 毫升培养基。将生物反应器置于旋转式离心模拟器培养箱中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。使用 1 毫升宽口吸头轻轻吹打，从超低吸附 24 孔板上分离类球体，并将其转移至组织培养皿中。

为选择足够优质的类球体，需在显微镜下检查其质量。高质量的类球体应具有均匀的大小、致密性和圆形度。向已平衡的生物反应器中加入五毫升新鲜培养基，并将类球体转移至其中。

然后用新鲜的培养基完全填充生物反应器，并将生物反应器置于转速为10至11 RPM的旋转培养箱中。每两到三天更换一次培养基，用新鲜培养基替换10毫升旧培养基。随着这些类球体的尺寸和数量增加，逐步提高培养箱的旋转速度。

获得球状体沉淀后，向沉淀中加入五倍体积的预冷0.2摩尔硫酸，用移液器反复吹打以破坏沉淀并释放组蛋白。离心获得上清液后，加入预冷的浓三氯乙酸，使终浓度达到25%至30%（体积比）。通过轻轻颠倒离心管数次混匀，然后按照文中所述进行离心。

弃去上清液后，使用玻璃巴氏吸管，用约 500 µL 冷丙酮和 0.1% 盐酸洗涤沉淀物及管壁，然后在 4 °C 条件下以 3,400 × g 离心 5 分钟。随后将离心管倒置以弃去上清液。使用玻璃巴氏吸管加入 500 µL 100% 冷丙酮洗涤沉淀物，并按前述方法再次离心。

弃去上清液后，小心地用移液枪彻底去除丙酮，并将样品在敞盖条件下干燥约20分钟。将沉淀物重悬于20微升含有15%至20%乙腈的100毫摩尔/升、pH为8的碳酸氢铵溶液中。涡旋混匀后，在1000 × g离心30秒使悬浮液沉降。

对于八个或更多样本，将每个重悬的样本转移至96孔板中。然后在通风橱中加入2 µL丙酸酐，通过移液吹打混合5次。迅速加入10 µL氢氧化铵，再次通过移液吹打混合5次。

在磁力搅拌器上混合HLB树脂。然后将70 µL HLB悬浮液加入置于96孔收集板上的96孔滤板的每个孔中。弃去滤过液后，用100 µL含0.1%三氟乙酸的溶液洗涤树脂。

将每个样品重悬于 100 微升 0.1% 三氟乙酸中后，将每个样品加入各孔中，并使用真空装置防止溅出。弃去滤过液后，用 100 微升 0.1% 三氟乙酸洗涤样品，并将滤板置于新的收集板上。接着，向每孔中加入 60 微升含 0.1% 三氟乙酸的 60% 乙腈溶液，并用真空装置防止溅出。

收集流穿部分，并在真空浓缩仪中干燥。将干燥后的收集板放入高效液相色谱仪中，按照文中所述运行液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）方法。本研究中，观察了以三维球状体形式培养的C3A肝细胞中常见组蛋白翻译后修饰的相对丰度。

在组蛋白蛋白衍生的肽段中，也可观察到单个氨基酸残基上的翻译后修饰。用丁酸钠处理类球体可增加组蛋白乙酰化的相对丰度，而用琥珀酸钠处理则增强组蛋白残基的琥珀酰化。该方法还展示了丁酸钠处理后组蛋白乙酰化的分布模式，以及琥珀酸钠处理后组蛋白琥珀酰化的分布模式。

结果还显示了不同组蛋白修饰之间的组合模式。当组蛋白H3衍生肽段的第9位赖氨酸残基含有两个甲基时，丁酸钠处理显著增强了该肽段第14位赖氨酸残基的乙酰化水平；但当第9位赖氨酸残基含一个或三个甲基时则无此效应。此外，还计算了H3衍生肽段中各单个修饰以及多种翻译后修饰组合的相对丰度。

在组蛋白 H4 来源的肽段中，也观察到丁酸钠处理后翻译后修饰的组合模式。同样，丁酸钠处理导致乙酰化水平显著升高。应特别注意尽量减少类球体在实验台上的暴露时间，并在脱盐步骤中防止样品洒出。该工作流程可用于在比快速增殖的贴壁细胞培养更接近生理状态的模型中探索实体组织中的染色质结构。