用于单细胞组蛋白翻译后修饰多重分析（sc-hPTM2）的自动化样本制备

我们正在通过一种自动化的多重方法推进单细胞蛋白质组学，以研究翻译后修饰的全基因组染色质异质性。该实验方案的难点在于皮克量级的蛋白质组制备、多重标记以及复杂组合修饰组蛋白肽段的解析。首先，在冰上预冷的PBS中重悬Hep G2/C3A肝细胞癌细胞，终浓度为每微升200至500个细胞。

将每个喷嘴的脉冲宽度和驱动电压设置为制造商提供的数值。为了获得最大拾取效率，确保两个喷嘴之间的Z轴偏移量相差小于50微米。确定每个喷嘴的最佳接触位置，并在喷嘴设置选项卡中比较Z轴高度读数。

对于tuplex多重检测方案，将单个载玻片加载到通风橱中的载玻片架上，然后转移至仪器中。使用移液器，将150微升LCMS级DMSO分装至新的PCR管中。将该PCR管放入清洗站的2号位置，管盖朝向仪器门方向。

开始DMSO运行。在吸取DMSO后，获得一次稳定的液滴。注意PDC透明度的变化。

可能需要增加电压。通过进行液滴体积检查来验证稳定性。执行喷头摄像头向导设置以校准摄像头。

分配DMSO，并让仪器自动冲洗喷嘴，同时对所有载玻片进行成像以进行质量控制。检查这些图像，确认每张载玻片上的DMSO液滴均匀，并检查是否存在缺失或偏离目标位置的液滴。吸取细胞悬液后，打开一个模块中的细胞，执行背景成像，然后运行定位程序以定义喷射区域。

运行分析，然后根据细胞大小和伸长程度对颗粒进行设门筛选。现在，用LCMS级水配制新鲜的消化主混合液。将溶液置于冰上，用真空泵脱气10分钟。

将消化液加到载玻片上后，让仪器自动冲洗喷嘴并对每张载玻片拍照。检查图像，确认每个液滴均均匀覆盖消化液。将载玻片在室温下孵育过夜，以完成消化过程。

启动蒸发程序并过夜消化后，检查图像。如果液滴已充分干燥，则停止程序；否则，单击继续，再干燥五分钟。

标记时，首先制备用于多重组蛋白衍生化的储备溶液。加样后，让仪器自动冲洗喷嘴并对每张载玻片拍照。检查图像以确认所有载玻片上的溶液分布均匀且液滴位置正确。

孵育完成后，加入羟胺溶液以终止反应。要采集样品时，在主选项卡中选择运行程序，然后在运行选项卡中启动运行。样品采集完成后，查看图像以检查是否存在任何错误。

完成上样后，取下上样板的盖子。然后在真空浓缩仪中用低温干燥样品。进行数据采集时，设置高效液相色谱方法。

设置质谱二级实验，包含50个质量电荷的隔离窗口、27%的高能碰撞解离以及1000%的自动增益控制目标。用橡胶密封垫覆盖样品板，并将其放入自动进样器中。获取原始文件后，先简要检查色谱图，然后使用EpiProfile 2.1版本分析原始数据。查看标准化组蛋白PTM丰度的输出表格，并将其用于后续分析。

对前20种组蛋白H3肽段变体进行了定量，展示了其在对照组和丁酸钠处理条件下的相对丰度。H3 K9乙酰化和H3 K14乙酰化在丁酸钠处理后均显示出更高的相对丰度，而H3 K9乙酰化K14乙酰化在处理细胞中似乎更加富集。

经丁酸钠处理后，总乙酰化水平升高，与对照组相比，处理组细胞的误差分布更广，反映出在单细胞水平上捕获到更高的异质性。单个及共发生的组蛋白修饰定量结果表明，组合型乙酰化状态受丁酸钠影响最为显著。丁酸钠处理组细胞更广泛的分散趋势表明，类球体中单个细胞间的生物学异质性增加。

本方案通过使科学家能够在单细胞水平上研究染色质状态，填补了表观遗传学研究领域的空白。该工作流程支持高通量样本制备、样本多重化以及无偏倚质谱分析，从而生成兼具高灵敏度和定量性的单细胞表观遗传数据。未来的研究将探索染色质调控如何影响癌症、代谢性疾病和衰老等疾病状态。