利用精密切割肺片研究气道和肺内动脉平滑肌的收缩调节
2022年5月5日
本方案描述了制备和利用小鼠精密切割肺片以评估气道和肺内动脉平滑肌收缩力的方法，该方法接近体内生理状态 体内 环境
肺切片（PCLS）可在近乎完整的组织环境中评估气道和血管平滑肌细胞的活性，从而为肺部研究提供一种极为宝贵的离体模型。在平滑肌研究方面，精密切割的肺切片能够保留平滑肌细胞的体内表型及其与周围结构的相互作用，同时允许对平滑肌细胞进行接触和操作，这对于在细胞水平上开展机制性研究具有重要意义。首先，将小鼠身体仰卧位放置于解剖板上。
用25G注射器针头固定尾巴、前肢和头部，并用70%乙醇对身体进行消毒。沿胸骨及膈肌上方的双侧下部肋骨小心切开胸腔。然后将剪刀尖端朝向远离肺组织的方向，剪除部分双侧腹侧肋骨，以暴露心脏。
观察到胸腔打开时肺叶会塌陷。使用剪刀去除小鼠颈部的软组织，以暴露气管。在气管的上端制造一个直径为1.2毫米的小孔，该孔应能允许20G Y型静脉导管尖端通过。
将Y形导管的一个接头端口连接至预先装有0.5毫升空气的3毫升注射器，另一端口连接至预先装有2毫升、已预热至42摄氏度的1.5%琼脂糖溶液的3毫升注射器。注入琼脂糖溶液以充满导管，随后将导管经开口插入气管5至8毫米。以每5秒1毫升的速度缓慢注射琼脂糖溶液。
观察到肺沿近端至远端轴扩张。当每个肺叶边缘充气后，停止注射。然后，从另一注射器注入 0.2 至 0.3 毫升空气，将残留的琼脂糖推入传导性气道，直至远端肺泡腔隙。
使用一对弯止血钳夹闭气管。为了灌注肺血管系统，用1毫升注射器吸取温热的6%明胶溶液，并将其连接至针式静脉导管。用明胶溶液填充导管后，将针头穿刺至靠近右心室下壁处。
将针头推进至右心室约2到3毫米处，并使针尖指向主肺动脉。缓慢向右心室及肺动脉血管内注射约0.2毫升的明胶溶液。注射后保持针头原位五分钟，并通过向心脏和肺部倾注冰冷的HBSS溶液冷却肺叶，随后将动物体置于冰箱中。
此步骤完成后，用剪刀将小鼠肺脏和心脏从周围结缔组织中分离出来。随后，分离各个肺叶，并将其置于冰上的 HBSS 溶液中保存。修整肺叶，调整其方向，使切割方向垂直于从肺门至肺表面的大部分气道。
使用超级胶水将其固定在标本柱顶部。使用带有新鲜薄剃刀刀片的振动切片机将肺叶切成150微米厚的切片。将切片收集到预先装有冷的HBSS溶液的无菌培养皿中。
将切片转移至盛有DMEM/F-12培养基的培养皿中，将培养皿置于37摄氏度培养箱中过夜，以备后续实验。将单个精密切割的肺切片放入盛有HBSS的24孔培养板的每个孔中。
将切片置于孔板中央，然后用移液器吸除HBSS溶液。在显微镜下找到切片中的目标气道和血管，随后用带有预先切割中央孔的尼龙网覆盖，以暴露目标气道血管区域。将一个中空金属垫圈置于网膜上方，以固定切片位置。
然后，加入 600 µL HBSS 溶液以浸没组织切片。10 分钟后，记录基线图像。为诱导气道或血管收缩，需小心用移液器吸除 HBSS 溶液，并加入含激动剂的 600 µL HBSS 溶液。
配制钙离子染料负载缓冲液时，首先将50微克染料、10微升DMSO和0.2克Pluronic F-12粉末溶于1毫升DMSO中。取10微升Pluronic溶液与10微升钙离子染料溶液混合，将该混合液加入含有200微摩尔磺溴酞的2毫升HBSS溶液中。
然后，将15个精密切割的肺组织片放入2毫升钙离子负载缓冲液中，在30摄氏度下孵育1小时，随后在含有100微摩尔磺溴酞钠的HBSS中孵育30分钟。接着，将负载了钙离子染料的组织片置于一块大盖玻片上。取高真空硅脂填充至连接18G钝针或200微升移液器吸头的3毫升注射器中，在盖玻片上沿组织片的上方和下方各绘制两条平行线。
用尼龙网覆盖切片，置于两条油脂线之间。将第二块盖玻片放在网膜上方，形成一个腔室。用移液器从一端向腔室内加入 HBSS 或激动剂溶液。
用滤纸从另一端吸去腔室中的液体。此时，切片腔室已准备好进行高速激光扫描共聚焦显微镜下的钙成像。在相差显微镜下观察到厚度为150 µm的精密切割肺切片中的肺气道动脉束。
静息状态下，通过立方上皮细胞及其邻近的肺动脉识别出气道。在暴露于乙酰甲胆碱后，管腔面积减小，而肺动脉对刺激无反应。通过管腔面积减少的百分比来量化气道的收缩反应，在培养一天和五天的样本中均表现出相似的剂量依赖性反应。
当到达外周肺野时，传导性气道分支形成围绕小叶内小动脉的呼吸性细支气管和肺泡囊。当内皮暴露于气道和肺动脉时，两者均会发生收缩，随后由NOC-5诱导产生舒张反应。在静息状态下，加载钙染料的肺组织切片在共聚焦荧光显微镜下显示气道和血管系统的平滑肌细胞荧光信号较弱。
当细胞暴露于激动剂时，细胞内钙荧光强度升高，并传播至整个细胞，这与振荡信号相关。从技术上讲，必须均匀地用琼脂糖灌注肺组织，避免快速或过量注射琼脂糖。每次操作结束时均应推动空气，以将琼脂糖从传导性气道冲洗至远端肺泡腔。
总之，利用精密切割的肺组织切片培养，可以提供多种肺平滑肌功能，并在体外模拟平滑肌功能失调。该方法还为筛选新的血管扩张剂或支气管扩张药物提供了理想的平台。
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概述
本研究概述了一种从小鼠制备精密切割肺切片（PCLS）的方案，用于在接近体内环境的条件下研究平滑肌的收缩性。通过保持体内的表型特征，这些切片可实现对肺部研究中平滑肌细胞功能的深入分析。
关键研究组成部分
研究领域
- 肺生理学
- 离体模型
- 平滑肌功能
背景
- 肺切片（PCLS）为机制研究提供了工具。
- 细胞间相互作用的保留对于准确评估至关重要。
- 该方法便于获取特定细胞类型以进行进一步分析。
使用的方法
- 从小鼠肺组织制备精密切割的肺片。
- 利用活体成像和药理学试剂评估肌肉收缩。
- 采用钙成像技术监测细胞活动。
主要结果
- 该方案成功保持了肺组织的结构完整性，适用于功能研究。
- 观察到在激动剂作用下收缩力增强，表明平滑肌细胞具有反应性。
- 研究结果支持肺切片（PCLS）在理解肺部平滑肌力学中的相关性。
结论
- 本研究证明了肺切片（PCLS）作为肺平滑肌分析的离体研究模型的有效性。
- 该方案提供的见解可能有助于理解呼吸系统疾病并开发治疗策略。
常见问题
行业应用价值
精密切割肺组织片（PCLS）可在接近天然组织的环境中，对气道和肺内动脉平滑肌的收缩功能进行离体研究，有助于在呼吸系统药物早期发现阶段进行机制性风险评估。该技术平台能够保留体内细胞表型及微环境相互作用，为目标验证和功能筛选提供可靠的预测依据。PCLS模型在肺部疾病研究领域中具有战略性地位，可有效衔接基础生物学发现与转化医学研究。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在完整的肺组织中直接评估平滑肌收缩功能的调控机制。
- 支持针对与疾病发病机制相关的Ca2+介导信号通路的机制研究。
- 通过保留天然的细胞-细胞和细胞-基质相互作用，促进功能靶点的验证。
- 为气道和血管反应的假设驱动型研究提供平台。
筛选与检测方法开发
- 提供可重复、定量的气道和血管收缩读数，用于化合物评估。
- 支持支气管扩张剂和血管扩张剂筛选的生物测定标准化。
- 适用于多种条件或遗传模型间比较研究的可扩展性。
- 为后续药理学测试准备经过验证的生物系统。
转化与临床前研究
- 与哮喘和肺动脉高压模型中与疾病相关的机制相一致。
- 通过在体外模拟平滑肌收缩功能失调，保持转化研究的连续性。
- 通过提供靶点结合的功能性证据，支持基于风险调整的推进决策。
- 通过定量成像分析收缩和信号转导反应，促进生物标志物的发现。
流程与工作流整合
PCLS 技术可整合呼吸道药物研发工作流程中的早期发现、先导化合物鉴定及临床前验证环节。
- 发现生物学：能够在肺组织中进行关于收缩调节及通路参与的假设验证。
- 筛选：提供可直接用于检测、可重复的模型，用于评估平滑肌的药理学调控。
- 分析：提供管腔面积减少和Ca2+信号动态的定量测量。
- 转化研究：将离体实验结果与体内疾病模型相连接，实现机制上的连续性。
- 企业级复用：提供可重复使用的平台，可适应多种呼吸系统疾病研究需求。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证和机制去风险的预测可信度。
- 操作价值：增强功能检测的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：改善决策进程中的立项或终止判断，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的呼吸系统项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备肺组织处理和活体成像技术方面的专业知识。
- 需要具备振动切片机切片、共聚焦显微镜和定量成像基础设施的使用条件。
- 需要跨团队对切片制备和检测方案进行标准化。
- 针对不同物种或疾病模型可能需要进行方法调整。
- 实际限制因素包括组织切片的存活时间以及组织质量可能存在的变异性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Inflation of Mouse Lungs
3:25
Sectioning of Lung Lobes
4:09
Analyzing Contractile Responses of Intrapulmonary Airways and Arteries
5:08
Analyzing Ca2+ Signaling of Airway or Vascular Smooth Muscle Cells
6:45
Results: Analyses of Airways and Pulmonary Arteries in Mouse Precision-Cut Lung Slices
8:07
Conclusion
