可视化大鼠腓肠肌内侧头中神经肌肉接头的形态学特征

本方案可用于评估正常和病理条件下神经肌肉接头的完整性和可塑性。该技术能够在单个肌肉切片上同时标记施万细胞以及突触前和突触后结构。安乐死成年雄性大鼠后，将其置于通风橱中，使用剪刀和镊子打开胸腔以暴露心脏。

从左心室向主动脉插入静脉导管，并剪开右心房。接着，用100毫升0.9%生理盐水开始灌注，直至从右心房流出的液体清澈为止。然后继续用250至300毫升含4%多聚甲醛的0.1摩尔磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）灌注10分钟。

灌注后，使用手术刀去除双侧后肢的皮肤，暴露双侧坐骨神经和内侧腓肠肌。用刀片仔细从后肢分离出双侧内侧腓肠肌，并将整块肌肉置于10毫升4%多聚甲醛中固定。两小时后，将肌肉从溶液中取出，在4°C条件下，用10毫升含25%蔗糖的0.1摩尔磷酸缓冲液进行一天的冷冻保护处理。

将肌肉组织浸入蔗糖溶液后，使用冷冻切片介质将其固定在滑动式切片机系统的冷冻台上。沿肌肉长轴方向进行水平切片，厚度为80微米。用毛笔将每孔7片冷冻切片有序地放入六孔培养板中，每孔加入10毫升0.1摩尔磷酸盐缓冲液。进行荧光染色时，在摇床上以每分钟20转的速度，将每孔4片切片与1.5毫升含有75微升10% Triton X-100和45微升正常驴血清的0.1摩尔磷酸盐缓冲液共同孵育。

30分钟后，将切片转移至1.5毫升混合的一抗溶液中，该溶液包含兔抗神经丝蛋白200（rabbit anti-neuro filament 200）、山羊抗囊泡乙酰胆碱转运体（goat anti-vesicular acetylcholine transporter），溶于0.1摩尔的PB缓冲液，并含有1%正常驴血清和0.5%Triton X-100，于4摄氏度孵育过夜。次日，在0.1摩尔PB缓冲液中，于20 rpm的摇床上将切片洗涤三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，将切片置于含二抗的混合溶液中孵育1小时，二抗包括驴抗兔AF 488（donkey anti-rabbit AF 488）和驴抗山羊AF 546（donkey anti-goat AF 546），以及α-银环蛇毒素AF 647（alpha bungaro toxin AF 647）和鬼笔环肽350（phalloidin 350）等生物标志物，溶于含1%正常驴血清和0.5%Triton X-100的0.1 M PB缓冲液中，孵育过程需避光。

孵育后，用PB缓冲液洗涤切片，并将其贴附于显微镜载玻片上。用蒸馏水中含50%甘油的封片剂加盖盖玻片。使用配备数值孔径为0.75的20倍物镜和数值孔径为0.95的40倍物镜的共聚焦成像系统观察并采集标本图像。

对于多重荧光成像，按照文本稿件中的描述设置每种生物标志物的激发和发射波长。将图像采集分辨率设置为 640 × 640 像素。接下来，设置起始和终止焦平面。

将步长设置为一或两微米。然后选择深度模式、图像采集和Z序列。对于20倍的低倍图像，使用105微米针孔，以两微米步长采集40个Z轴堆栈图像。

选择投影模式或表面形貌模式，并沿 Z 轴进行强度投影，以将所有图像整合为一幅整体聚焦的图像。对于 40 倍的高倍图像，设置步长为 1 微米，共采集 80 层 Z 轴图像，放大倍数设为 2，针孔直径为 105 微米。将所有图像整合为一幅整体聚焦的图像。

使用图像处理系统以三维模式重建图像。此处展示了腓肠肌内侧头中神经丝蛋白200阳性神经纤维、囊泡乙酰胆碱转运体阳性突触前终末、α-银环蛇毒素阳性突触后乙酰胆碱受体、S100阳性突触周围许旺细胞、鬼笔环肽阳性肌纤维以及DAPI标记的细胞核的代表性空间分布关系。神经丝蛋白200阳性的神经纤维成束走行。

这些神经纤维向囊泡乙酰胆碱转运体阳性的突触前终末发出分支，与α-环蛇毒素阳性的突触后乙酰胆碱受体形成镜像对应关系。此外，在靠近突触前终末处，S100阳性的突触周雪旺细胞被检测到分布于神经丝蛋白200阳性的神经纤维周围。这种空间关联性还以三维模式进一步呈现，从不同角度展示了神经肌肉接头的详细形态学特征。

为了在肌肉切片中观察到更多的成像区域，必须沿肌肉长轴水平切割，厚度为 80 微米。