大鼠后肢的获取与脱细胞化方法 离体 基于灌注的生物反应器用于带血管复合组织异体移植

我们已建立了一种用于肢体脱细胞的小型动物模型。该模型有助于推动血管化复合组织脱细胞与再细胞化概念验证研究。免疫抑制方案是血管化复合组织异体移植的主要限制因素之一。

可通过脱细胞处理降低组织的免疫原性。首先，使用10号手术刀片沿腹股沟韧带从外侧向内侧方向做皮肤切口，同时用Adson镊子夹持周围皮肤。当暴露皮下脂肪后，采用钝性分离法仔细分离脂肪组织，找到腹壁上血管。

使用显微剪刀向近端解剖，暴露腹股沟韧带水平的股神经、股动脉和股静脉。在解剖显微镜下辨认股血管，并用精细镊子向近端分离股动脉和股静脉，从动脉网络的分叉点获取足够的长度。随后，使用6-0缝线分别结扎股静脉和股动脉。

接下来，在不破坏已结扎的股血管的情况下，对后肢其余部分进行环周解剖，并使用骨剪在股骨中段将其切断。为完全游离后肢，使用显微剪刀在结扎线远端切断已结扎的股血管，并在解剖显微镜下用24号套管针插入股动脉进行插管。随后用肝素化生理盐水冲洗，直至股静脉流出液变澄清为止。

通过在导管化的血管周围打一个缝合结，并在导管远端再打一个缝合结来固定导管，确保将导管置于近端位置，以防止阻塞分支点。随后，将获取的后肢和PBS一同浸入直至脱细胞处理。为构建生物反应器，放置已灭菌的腔室，并在入口、出口和补充液管路上分别旋紧三个一次性三通旋塞阀，确保补充液口的旋塞阀其余两个端口已加盖封闭，以防止泄漏。

将先前制备的硅胶管连接到进液和出液管路的旋塞上。然后，将蠕动泵管连接到硅胶管上。将盒卡固定在蠕动泵管上后，将其放置于蠕动泵中。

接下来，将一根硅胶管连接到上一步中流出管路的蠕动泵管末端。在另一端连接一支1毫升的血清移液管，并将连接有血清移液管的一端浸入废液储液瓶中。然后，将连接血清移液管的管路末端浸入洗涤剂储液瓶中，并立即用封口膜密封洗涤剂储液瓶的开口。

从一升玻璃瓶中加入0.25% SDS至生物反应器腔室的一半高度。然后用Adson镊子夹取获取的后肢，小心地将其悬挂在生物反应器腔室内。使用两把Adson镊子，用其中一把夹住套管，同时将后肢的套管部分沿镊子引导至进液管路。

使用另一对镊子旋转并固定进液管路至套管。固定后，根据需要从1升玻璃瓶中添加更多0.25% SDS，以完全浸没肢体，确保出口端口也浸没在生物反应器储液池中，并维持持续的流出。然后，将一次性注射器滤器连接至生物反应器腔室盖子上的通气口，并将盖子固定在生物反应器上，确保腔室四周均密封。

为了排出管路中的空气并启动灌注回路，使用新的一次性10毫升注射器，通过入口管路上的三通旋塞从洗涤剂储液罐中吸取洗涤剂。吸取后，将同一液体注入出口管路的三通旋塞中。接着，将带有管路的盒式组件压下并牢固固定到蠕动泵中。

然后，使用电源按钮开启蠕动泵。在蠕动泵的屏幕界面上，使用箭头键进入第二个选项卡，将第一通道的灌注速率设置为以输入流速作为输送模式，并将灌注速率设为每分钟1毫升，同时根据装置的设置确保流动方向正确。校准蠕动泵，以确保通过进液管路输送的液体量，以及从出液管路引出的液体量在两者之间保持一致，并确保泵管内径（ID）设置为1.85毫米。

通过按下键盘上的电源按钮，以每分钟1毫升的流速对进液管路和出液管路启动机器灌注，开始脱细胞过程。监测并确保进液管路和出液管路的灌注持续进行。根据需要，通过补液口向生物反应器储液罐中补充1升0.25% STS溶液。

随后，观察组织是否呈现白色半透明外观，该现象将在第五天出现，表明大鼠后肢已脱细胞。确认脱细胞完成后，将洗涤剂储液瓶更换为磷酸盐缓冲液（PBS）和含1%抗生素-抗真菌剂的储液瓶，并用封口膜密封烧瓶开口。以每分钟1毫升的流速开始PBS和1%抗生素-抗真菌剂灌注，持续两天。

将 PBS 和 1% 抗生素-抗真菌剂储液更换为 200 毫升 0.1% 过氧乙酸和 4% 乙醇储液，并以每分钟 1 毫升的速度开始灌注，持续 2 小时。在生物安全柜内，使用两把无菌 Adson 镊子将后肢与进液管路断开，其中一把镊子用于旋转进液管路，另一把夹持套管，确保不牵拉套管以防止脱管。将肢体储存于含有 PBS 和 1% 抗生素-抗真菌剂的 500 毫升玻璃瓶中，在 4 摄氏度条件下保存，以备后续使用。

脱细胞处理后的股动脉和股静脉均显示各层及周围结缔组织中细胞核成分完全消失，表现为缺乏天然血管中可见的蓝色染色细胞核。股静脉和股动脉的内膜、中膜和外膜结构在脱细胞处理后均得以保留。股神经组织结构保持完整，包括神经内膜。

脱细胞后，骨组织整体结构得以保留，但骨细胞以及周围骨内膜和骨外膜层的染色细胞核消失。皮肤组织表皮层和真皮层的细胞均消失，真皮层保留了与天然皮肤组织相似的胶原纤维。

最后，骨骼肌的横切面显示，原本位于肌内膜周边区域的细胞核出现丢失。去细胞化后，肌原纤维内容物仍保留在相应的肌束内。同时采用PicoGreen法进行DNA定量，结果显示股血管、神经、皮肤、肌肉和骨组织中的DNA含量均显著降低。

按照本方案，可对脱细胞肢体进行进一步表征，包括通过组织学和生物化学方法检测细胞外基质，以及利用影像学评估血管系统。此外，可使用组织特异性细胞对脱细胞支架进行再细胞化。