定制灌注生物反应器中猪带血管皮瓣的获取与灌注脱细胞处理

本方法描述了三种带血管的猪皮瓣的手术获取及其后续的灌注脱细胞过程。该方法可为利用组织脱细胞与再细胞化策略再生猪皮瓣的研究提供支持。该技术的主要优势在于其具有良好的通用性，可在结构简单的生物反应器装置中，实现多种带血管猪皮瓣的充分脱细胞。

此处所述技术可广泛应用于其他带血管瓣膜，作为重建手术中使用猪瓣膜的一种潜在组织工程解决方案。首先，取约50厘米长的LS16铂涂层硅胶管，制备流入和流出管路。将一端连接至黄色三通泵管，另一端连接无菌2毫升血清移液管，用于将灌注液从洗涤剂储液罐输送至生物反应器腔室。

将腔室和管路分别用无菌包装包裹后进行高压灭菌。进行大网膜瓣取材时，将一只12周龄的麻醉约克夏猪置于仰卧位，常规无菌准备腹部。行剑突至脐部的剖腹切口进入腹腔，将胃向上游离，并将大网膜置于手术视野中。

从大弯左侧开始，此处胃网膜左动脉与脾动脉相连接，使用直头 Stevens 腱膜剪沿胃网膜左动脉和静脉进行游离。随后分别使用结扎线或结扎夹将其结扎并切断。沿胃大弯从左向右依次结扎并切断由大网膜发出、供应胃大弯的短小血管分支。

继续游离大网膜，直至遇到胃网膜右血管与胃十二指肠动脉的汇合处。随后结扎并切断胃网膜右动脉和静脉，以游离网膜瓣，为后续瓣膜插管创造条件。对于阔筋膜张肌瓣的切取，将猪置于侧卧位。

从髂前上棘（ASIS）向髌骨外侧标记皮瓣的内侧边界，并向尾侧约8至10厘米处标记后界。使用手术刀在髌骨远端边缘做一锐性切口。逐层加深切口，穿过皮下组织，到达股直肌表面的筋膜，并沿已标记的边界继续向髂前上棘方向延伸切口。

仅分离筋膜瓣时，需去除覆盖于其上的皮肤组织，暴露下方的筋膜层。随后结扎或电凝通往皮肤的小穿支血管。回到皮瓣的远端边缘，切开深筋膜。

将筋膜从下方的股外侧肌表面游离，向髂前上棘（ASIS）方向牵拉。沿血管蒂向股深动静脉方向追踪，解剖出供应筋膜瓣的旋股外侧动脉及伴行静脉，并将其骨骼化。随后在血管蒂近端、即其汇入股深血管处结扎并切断筋膜瓣的动静脉，以备后续插管操作。

进行前臂桡侧皮瓣切取时，在猪的前臂桡侧延长部分标记一个 3 厘米 × 3 厘米的正方形区域。在皮瓣近端边缘中点与肘窝之间画一条线，以标示桡动脉蒂的大致走行。通过触诊确认动脉的走行路径。

接下来，使用手术刀在远端切开皮肤，深度达前臂筋膜。用肌腱剪进行钝性分离，直至暴露桡动脉及其伴行静脉。然后使用结扎线或结扎夹结扎并切断动脉和静脉。

沿标记皮肤方块的桡侧和尺侧边缘继续进行皮肤切口。然后使用手术刀或电凝设备，从尺侧向桡侧方向分离皮瓣，将其从下方的桡骨表面游离，并向近端肘窝方向掀起皮瓣。使用肌腱剪，在肘窝处近端解剖桡动脉及其伴行静脉，使其骨骼化，此处桡动脉及其伴行静脉分别汇入肱动脉和肱静脉。

从周围纤维脂肪组织中解剖出血管，以游离血管蒂。随后分别结扎并切断动脉和静脉，以游离桡动脉前臂皮瓣。接着用20至24号套管针穿刺血管蒂血管，并以3-0丝线固定。

将肝素化生理盐水冲注入皮瓣动脉套管，直至观察到清晰的静脉流出液。在超净工作台内操作时，将皮瓣放入生物反应器的组织腔室中。使用无菌肝素化生理盐水预冲流入管路以排除残留空气，并调整皮瓣位置，使皮瓣动脉套管与雄性鲁尔接头相连。

然后使用无菌止血钳将动脉套管旋紧在连接器上。接着通过三通阀冲洗肝素化生理盐水，检查鲁尔接头是否无泄漏，并确认灌注液能够流入组织且有静脉流出液出现。关闭组织室盖后，将带有黄色三通泵管的流入管路连接至组织室的流入三通阀。

同时，将一个内置压力传感器换能器连接到灌流入口的三通旋塞阀，用于监测灌流压力。接着，打开入口蠕动泵，在初始界面中使用箭头切换至第三个选项卡，将管路内径设置为1.85毫米。然后从第二个选项卡设置灌流速率。

输入速率作为输送模式设定为每分钟2毫升。确保屏幕显示的流向正确。将三停泵管路装载到与之匹配的蠕动泵卡匣中。

将流出泵的流速设置为每分钟4毫升。使用黄色三通泵管将流出管路连接至组织腔室的流出旋塞。然后将三通泵管装入蠕动泵，并通过按下两台泵上的电源按钮启动两台泵的流动。

在组织腔室中使用肝素化生理盐水对皮瓣进行灌注脱细胞，持续15分钟，以清除残留的血凝块。完成后，将残余的生理盐水替换为500毫升十二烷基硫酸钠（SDS）脱细胞溶液，完全浸没皮瓣。接着，将进液管转移至SDS溶液中，对组织进行充分灌注。

SDS 脱细胞后，在用 PBS 灌注皮瓣一天之前，吸除残留的 SDS。SDS 灌注脱细胞后，依次将皮瓣在 DNA 酶溶液中灌注两小时，然后在 PBS 中灌注一天，随后将进液管转入含蒸馏水的过氧乙酸和乙醇溶液中，灌注三小时以对皮瓣进行消毒。完成后，无菌取出皮瓣，并将其浸入含 1% 抗生素和抗真菌剂的 PBS 中洗涤两次，每次 15 分钟。

将皮瓣储存在 4 摄氏度直至准备进行再细胞化。使用 3 至 10 毫米的打孔活检工具获取组织样本，以评估脱细胞皮瓣。在手动控制下冲洗的脱细胞皮瓣显示出从大网膜、阔筋膜张肌和桡前臂皮瓣的自由引流静脉套管中有流出液的证据。

原生大网膜、阔筋膜张肌和桡侧前臂皮瓣的宏观形态在获取后立即呈现粉红色。相比之下，脱细胞组织则表现为特征性的白色或不透明外观。对原生组织进行苏木精和伊红染色的组织学检查显示存在蓝色细胞核。

在脱细胞皮瓣中，组织学染色显示细胞成分消失，无蓝色细胞核染色，表明形成了无细胞的组织支架。对DNA含量的进一步定量分析显示，与天然组织相比，无细胞支架中的DNA含量显著减少。最重要的考虑因素是在获取过程中采用的外科技术，需注意避免对皮瓣蒂部造成损伤，以便后续进行灌注脱细胞处理。

灌注脱细胞后，可利用特定组织的细胞群体对所得皮瓣进行再细胞化，以再生原有的组织区室。