可现场部署的结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR-Cas12a技术的Candidatus Liberibacter asiaticus检测方法
2022年12月23日
本研究建立了一种基于重组酶聚合酶扩增联合CRISPR-Cas12a的快速、灵敏且便携的Candidatus Liberibacter asiaticus检测方法。
黄龙病，简称HLB，是一种在全球范围内具有毁灭性的柑橘病害。在主要的柑橘生产国，如中国和美国，该病由局限于韧皮部的细菌——亚洲韧皮杆菌（Candidatus Liberibacter asiaticus，简称CLas）引起。
CLas的早期检测对种植者至关重要，有助于及时干预并防止病害传播。因此，我们开发了一种结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR-Cas12a系统的快速、便携式黄龙病诊断新方法，我们将其称为CLas-DETECTR。
我们平台的灵敏度远高于PCR。此外，当使用叶片样本时，其结果与qPCR相似。与传统的CLas检测相比，我们的方法可在90分钟内完成，并且在等温条件下进行。
结果也可以通过手持式荧光检测设备在野外进行可视化。CLas-DETECTR 包含四个步骤：溶液配制、柑橘总 DNA 提取、等温 DNA 扩增以及结果可视化。CLas-DETECTR 检测方法的示意图如下所示。
缓冲液A、溶液B和溶液C按方案所述进行配制。为节省时间并使该方法适用于田间CLas检测，采用基于大肠杆菌聚乙二醇的方法获取粗制植物提取物用于DNA扩增。该工具使用柑橘叶片。
从叶片上打取少量叶圆片。将叶圆片放入一个1.5毫升的Eppendorf管中。然后，向管中加入200微升缓冲液A。
使用塑料棒手动研磨叶片圆片，直至匀浆顺滑。将离心管静置10分钟。随后将上清液用于DNA扩增。
进行等温DNA扩增时，取步骤2.3上清液1微升和乙酸镁1微升加入溶液B中，充分混匀。在实验室中，将混合物置于简易孵育器中，37摄氏度孵育15分钟。为观察结果，取步骤3.2所得混合液10微升加入溶液C中，充分混匀。
在37摄氏度的培养箱中孵育60分钟。佩戴护目镜，通过手持式荧光检测装置观察绿色荧光信号。为检测CLas-DETECTR的特异性，首先使用农杆菌GV3101（Agrobacterium tumefaciens GV3101）、柑橘黄单胞菌亚种（Xanthomonas citri subsp.）的纯菌落进行测试。
柑橘溃疡病菌（citri）以及本实验室分离的稳定伯克霍尔德菌（Burkholderia stabilis）菌株1440用于提取基因组DNA。随后，这三种细菌的基因组DNA以及CLas阳性的Newhall叶片基因组DNA均用于CLas-DETECTR检测。为测试CLas-DETECTR的灵敏度，按照本方案所述，采用PCR、CLas-DETECTR和qPCR对一系列CLas DNA片段稀释液进行检测。在完成特异性和灵敏度测试后，应用CLas-DETECTR方法检测田间样本中CLas的存在情况。
叶片样本采自中国江西省赣南师范大学校园内种质资源苗圃中生长的纽荷尔橙树。同时采用了实验室常用的可靠CLas检测方法——qPCR进行检测。来自感染HLB和未感染HLB的纽荷尔橙树的叶片样本（本实验室已确认其CLas的存在）被用于CLas-DETECTR检测。
在HLB感染的样品中检测到绿色荧光信号，而在HLB未感染样品和阴性对照中未检测到。我们利用从其他细菌中提取的核酸确定了CLas-DETECTR的特异性。在CLas-DETECTR检测中，仅从CLas阳性Newhall叶片中提取的基因组DNA显示出绿色荧光信号。
从农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101、柑橘黄单胞菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri）和稳定伯克霍尔德菌（Burkholderia stabilis）1440菌株中提取的基因组DNA均未产生检测信号，表明CLas-DETECTR可特异性地检测CLas。我们还使用一系列CLas DNA稀释液对CLas-DETECTR的灵敏度进行了测试，具体稀释梯度见实验方案。
PCR 每兆升可检测到 201 个拷贝。相比之下，CLas-DETECTR 每兆升可检测到 2.01 个拷贝，表明其可作为高灵敏度的田间诊断工具。qPCR 每兆升可检测到 0.201 个拷贝，且其 Ct 值高于 36。
因此，当使用稀释的CLas特异性扩增子时，CLas-DETECTR的灵敏度比传统PCR高两个数量级，但比qPCR低一个数量级。最后，重新评估了CLas-DETECTR用于田间样本的可行性，并将其灵敏度与qPCR进行了比较。图中所示如下。
当CLas浓度低于每兆升0.2拷贝时，Ct值高于36，这是一个非常低的浓度。在15个样本中，通过qPCR检测，样本1、2、3、4、8、10、13和14的Ct值均小于36，可观察到明显的绿色荧光信号。
另一方面，当通过qPCR检测到样品6、7、9、12和15的Ct值无法确定时，未观察到绿色荧光信号。此外，当样品5和11的qPCR检测Ct值高于36时，仅观察到微弱的绿色荧光信号。结果表明，我们的平台是一种快速、稳健且灵敏的田间HLB诊断工具。
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概述
本研究旨在解决柑橘黄龙病病原体——亚洲韧皮杆菌（Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas）快速准确检测的需求。一种名为CLas-DETECTR的新方法结合了重组酶聚合酶扩增技术与CRISPR-Cas12a技术，可在田间实现便携、灵敏的检测。
关键研究组成部分
研究领域
- 植物病理学
- 农业诊断
- 微生物遗传学
背景
- 黄龙病（HLB）对全球柑橘生产造成严重影响。
- 对韧皮部难养菌（CLas）的早期检测对于防止病害传播至关重要。
- 现有方法（如PCR）存在局限性，需进一步改进以提高其在田间应用的可行性。
使用的方法
- 重组酶聚合酶扩增联合CRISPR-Cas12a
- 采用柑橘叶片的田间样品进行检测。
- 利用荧光检测技术实现结果可视化。
主要结果
- CLas-DETECTR 的灵敏度显著高于标准 PCR。
- 仅在 CLas 阳性样本中观察到特异性荧光。
- 该方法在等温条件下可在 90 分钟内得出结果。
结论
- 该研究证明，CLas-DETECTR 是一种用于柑橘黄龙病（HLB）的可靠且灵敏的诊断工具。
- 该方法可促进及时干预，从而有效防控柑橘病害。
常见问题
行业重要性概述
快速、可现场部署的Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）检测技术解决了农业病原体监测中的一个关键瓶颈，有助于更早地干预和控制黄龙病（HLB）疫情暴发。将重组酶聚合酶扩增技术与CRISPR-Cas12a相结合，可实现高灵敏度和高特异性，支持在实际需求现场做出可靠决策。该诊断技术的进步提升了农业生物技术领域疾病管理流程中的预测准确性和操作灵活性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够快速验证植物体系中病原体的存在假设。
- 通过基于CRISPR的特异性实现检测靶标的功能验证。
- 可区分柑橘黄龙病菌（CLas）与其他柑橘病原体，有助于降低生物学风险。
- 提高早期干预策略的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游诊断工作流程准备经过验证的植物DNA提取物。
- 提供标准化、可重复且定量的荧光读数。
- 无需实验室PCR基础设施，即可实现可扩展、适用于现场的筛查。
- 支持对样本状态进行可靠评估，以实现快速分诊。
转化与临床前研究
- 将诊断结果与疾病相关的实际环境条件对齐，以实现转化连续性。
- 连接实验室检测性能与真实世界样本的变异性。
- 降低检测平台向更广泛农业应用推进过程中的风险。
- 通过在复杂基质中确认靶标特异性，提供机制层面的风险降低依据。
流程与工作流整合
该方法从早期发现到田间验证进行整合，支持从假设检验到农业生物技术中可操作诊断的各项工作流程。
- 发现生物学：利用 CRISPR-Cas12a 介导的检测方法确认病原体的存在性与特异性。
- 筛查：提供快速、可重复且定量的荧光输出，用于样本分检。
- 分析：提供与 PCR 和 qPCR 相比的灵敏度阈值及性能比较数据。
- 转化研究：展示从实验室验证到柑橘样本现场应用的连续性。
- 企业级复用：建立一种便携、可重复使用的诊断平台，可适配于其他植物病原体的检测。
运营与企业影响
- 科学价值：提高病原体检测的预测可信度，降低检测结果的不确定性。
- 操作价值：无需复杂仪器即可实现标准化、快速且适用于现场的诊断。
- 战略价值：支持在疾病管理和资源分配方面及时做出实施或中止决策。
- 组合影响：增强对诊断和干预策略的风险调整后优先级排序能力。
实施注意事项
- 需要具备核酸提取和等温扩增技术方面的专业知识。
- 需要配备手持式荧光检测设备，以便在野外进行可视化检测。
- 要求不同团队在样本制备和检测操作方面实现标准化。
- 通过优化实验方案，可适用于多种植物基质。
- 受限于对CRISPR-Cas12a试剂及兼容荧光检测基础设施的需求。
