基于CRISPR的现场快速诊断技术及其预混冻干试剂

我们正在开发一种用于检测传染病遗传物质的即时检测方法。该检测方法采用等温核酸扩增技术和基于CRISPR的检测技术。其具有与PCR相似的高特异性，能够检测微小的序列差异，包括单核苷酸多态性，并可实现多重检测。

基于CRISPR的渗透反应包含多种组分和效应，且在临床检测现场难以操作。由于基于CRISPR的渗透检测具有高度敏感性，存在交叉污染的风险，可能导致假阳性结果。幸运的是，如果能够简化反应的操作流程，这一问题可以得到缓解。

我们提供一种简便易用的方法，通过结合等温扩增技术和基于CRISPR的试剂来检测疾病病原体和遗传标志物。这些试剂易于储存和使用。我们还提供了一些解决使用这些方法和试剂时常见问题的建议，使人们更易于应用这些技术。

本方案采用冻干试剂，便于运输和储存。冻干试剂可在使用现场轻松重悬，并保持高效的扩增和检测性能。我们希望将CRISPR诊断技术应用于地方性及新发传染病的检测。

如果能够在临床现场常规且准确地进行此项检测，则可为抗病毒和抗生素治疗方案提供依据， potentially save lives, reduce drug overuse and the development of resistance. 首先，将三甘氨酸溶液在 60 摄氏度下孵育。从冰箱中取出三个 RPA 干粉条管。

轻轻敲击排管，使其脱离白色沉淀物。将三个沉淀物全部转移至一个1.5毫升微量离心管A中。用移液器加入25微升无核酸酶水，冲洗排管中残留的RPA粉末。将洗涤液转移至一个新的1.5毫升微量离心管B中，然后向B管中加入10微升0.57摩尔三甘氨酸溶液和10微升引物混合液。充分涡旋振荡后短暂离心，立即将管子置于冰上。

接下来，向主混合管B中加入28.4 µL的5倍RPA缓冲液。通过用力弹击或多次振荡充分混匀。将A管中收集的沉淀物转移至主混合管B中，并反复倒置管子或用手指轻弹管底以混匀。观察溶液是否呈现均一、单相状态。

将离心管置于冰上，然后向主混合管中加入 0.71 µL 逆转录酶和 2.84 µL RNase H。轻轻弹击或反复上下颠倒主混合管多次。短暂离心后，立即将离心管放回冰上。

现在，将主混合液分装至10个预冷的1.5毫升离心管中，每管8.4微升，并将离心管置于冰上。分装后，将离心管放入浸没于液氮中的金属架中，以准备进行冻干。在冻干机中，检查冷凝器和搁板的温度。

现在，用一张洁净的白纸覆盖金属架上敞口的离心管。将装有敞口离心管的金属架放入冷冻干燥机的搁板中，并关闭搁板门。然后，选择所需的程序并按下启动键。

二次干燥步骤进行30分钟后，按停止键。打开真空释放阀以释放压力。从搁板上取下支架后，立即盖紧管盖。

首先，将三甘氨酸溶液在 60 摄氏度下孵育。从冰箱中取出三管 RPA 冻干粉条状管。轻轻将条状管在实验台面上敲击，使白色冻干粉脱离管壁。

将全部三个沉淀物转移至一个1.5毫升的微量离心管A中。加入25微升无核酸酶水，冲洗反应条管中残留的RPA粉末，然后将洗涤液转移至一个新的1.5毫升微量离心管B中。接着，向主混合液管B中加入10微升0.57摩尔三甘氨酸溶液和10微升引物混合液。充分涡旋振荡后离心，立即将管子置于冰上。随后，向主混合液管B中加入28.4微升5倍浓度的RPA缓冲液。通过用力轻弹管壁或多次振荡，彻底混匀。

将A管中收集的沉淀转移至主混合液B管中，倒置试管或用手指轻弹试管底部数次以混匀。观察溶液是否呈现均一、单相状态。将试管置于冰上，然后向主混合液管中加入0.71 µL逆转录酶和2.84 µL RNase H。

轻轻敲击或反复颠倒混匀主混合液管，短暂离心后置于冰上。取8.4微升主混合液，分装至10个预冷的1.5毫升离心管中，并将离心管置于冰上。

分装后，将试管放入浸没于液氮中的金属架中，以备冻干。在冷冻干燥机上，检查冷凝器和搁板的温度。然后，用一张洁净的白纸覆盖金属架上敞口的试管。

将金属架连同敞口的管子一起放入冷冻干燥机的搁板上，关闭搁板门，然后选择所需的程序并按下启动。在二次干燥步骤进行30分钟后，按下停止。打开真空释放阀以释放压力。从搁板上取出金属架后，立即为管子加盖封口。

首先，将热孵育器预热至 42 摄氏度。向含有冻干预混 RT-RPA 小球的离心管管壁加入一微升乙酸镁和乙酸钾溶液混合物。用 12.4 微升 RNA 样品重悬小球。

为启动RT-RPA反应，将加入的溶液在室温下使用小型离心机瞬时离心3秒。轻轻敲击离心管以充分混匀管内成分，随后再次瞬时离心。将反应体系置于预热的恒温振荡孵育器中，在42摄氏度下孵育60分钟。

反应结束后，取出反应管并置于冰上，然后进行 CRISPR/Cas 检测。进行核酸检测时，打开荧光酶标仪，设置并将酶标仪预热至 37 摄氏度，并选择程序，随后将 384 孔板放在冰上。

为了重悬冻干的CRISPR/Cas预混检测反应体系，加入17微升8毫摩尔的氯化镁溶液。通过轻轻敲击离心管混匀。短暂离心3秒后，将离心管置于冰上。

将18微升重悬的反应混合物转移至预冷的384孔板的每个孔中，冰上操作。向每个反应孔中加入2微升制备好的RPA产物。从冰上取出孔板。

迅速将其放入预热的荧光酶标仪中并按下开始按钮。对于冻干的预混Cas13a反应体系，添加6%海藻糖或2%蔗糖均能在冻干后良好地保持反应效率。用于RT-RPA和Cas13a反应的冻干预混试剂在-20摄氏度下至少可稳定保存八个月。