细胞追踪的正电子发射断层成像：细胞放射性标记方法

本方案描述了一种对细胞和锆-89-DBN进行放射性标记的逐步方法，并通过正电子发射断层扫描（PET）实现无创追踪。该技术还提供了一种可靠且稳定的方法，通过将锆-89-DBN共价结合至细胞表面蛋白的伯胺基团来实现细胞的放射性标记。从事神经系统疾病及多种癌症细胞治疗研究的临床医生和科研人员，可通过本方案借助无创PET成像深入理解细胞治疗药物的药代动力学特征。

本详细实验方案为初学者学习和掌握该放射性标记技术提供了指导。在关键步骤中增加的附加说明有助于新手用户排查问题。首先，准备一个装有约100毫克羟肟酸树脂的层析柱，用8毫升纯无水乙腈洗涤层析柱以活化树脂，随后用5至6毫升空气冲洗。

向柱中加入2毫升0.5 N的盐酸。再通入5至6毫升空气冲洗后，缓慢将含有锆-89和天然钇的溶液上样至羟肟酸树脂。用20毫升2 N盐酸洗涤羟肟酸树脂，去除未结合的天然钇，随后用10毫升去离子水冲洗。

为了以锆-89磷酸氢盐的形式洗脱锆，向柱中加入0.5毫升1.2摩尔的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，并让其在柱上静置30分钟。再加入1.5毫升1.2摩尔的缓冲液以将锆从柱中洗脱出来。接下来，取约120微升用缓冲液配制的锆-89磷酸氢盐，用HEPES-KOH和碳酸钾中和溶液，使pH值达到7.528。

将4微升新配制的5毫摩尔DFO-Bn-NCS加入约285微升中和的锆-89磷酸氢盐溶液中，用移液器混匀。在将锆与钇分离后，向层析柱中加入0.5毫升1摩尔草酸，静置1分钟，以草酸锆-89的形式洗脱锆。

向柱中再加入 2.5 毫升 1 摩尔的草酸。为将草酸锆-89 转化为氯化锆-89，先用 6 毫升乙腈洗涤阴离子交换柱，随后用 5 至 6 毫升空气冲洗。然后，用 10 毫升生理盐水洗涤柱子，再用空气冲洗一次。

缓慢将含有草酸锆-89的溶液上样至活化的阴离子交换柱，然后用空气重新洗涤。接着用50毫升去离子水洗涤柱子，以去除未结合的草酸根离子。为以氯化锆-89的形式洗脱锆，向柱中加入0.1毫升1当量的盐酸，并使其在柱上静置1分钟。

用额外的0.4毫升1摩尔盐酸将锆从柱中洗脱。将洗脱的氯化锆-89置于V型小瓶中，在65摄氏度的加热块中，持续通入氮气流10至30分钟，使其干燥，然后将干燥的氯化锆-89溶于水中。在1.5毫升微量离心管中，用500微升HEPES缓冲的HBSS制备约含600万个细胞的500微升细胞悬液，并加入约100微升配制好的锆-89-DBN。

使用微量移液器轻轻吹打溶液，将锆-89-DBN 与细胞悬液混合。将细胞与锆-89-DBN 混合物置于摇床中，在 25 至 37 摄氏度、约 550 RPM 条件下孵育 30 至 45 分钟，以实现细胞标记。使用新配制的放射性 TLC 溶剂对细胞放射性标记反应进行放射性薄层色谱分析。

使用屏幕上显示的公式计算 Rf 值为 0.01 至 0.02 时的放射性百分比。在另一个 1.5 毫升微量离心管中，将约 100 微升的配制好的锆-89-DBN 与约 500 微升 HEPES 缓冲的 HBSS 混合，作为无细胞对照用于背景校正。使用屏幕上显示的公式计算 Rf 值为 0.01 至 0.02 时的放射性百分比，然后通过将两个计算得到的放射性百分比相减，计算有效细胞放射性标记率。

确认放射性标记完成后，加入600微升预冷的、适合细胞的完全培养基，以终止放射性标记反应。在4摄氏度下，以96×g离心10分钟，弃去上清液。

用移液器将500微升预冷的培养基反复吹打，轻柔重悬沉淀的细胞。在4摄氏度下以96×g离心10分钟，弃去上清液。接下来，根据屏幕上显示的公式计算经过所有洗涤步骤后的最终放射性标记效率。

为确保放射性标记细胞的质量，需对最终的放射性标记细胞悬液进行肉眼观察；若无细胞团块存在，则在完成放射性标记及洗涤步骤后一小时内，使用磷酸盐缓冲液（PBS）配制的0.4%台盼蓝溶液进行台盼蓝排斥法活率检测。通过放射性薄层色谱法（TLC）测定发现，DFO-Bn-NCS 对锆-89的螯合效率在使用锆-89磷酸氢盐与锆-89氯化物时存在差异。此处展示了多种细胞经锆-89放射性标记后在七天内的稳定性。

在所有研究的细胞中，放射性标记细胞对锆-89放射活性的保留均较为稳定，标记后七天内仅观察到可忽略的外排现象。不同细胞类型使用锆-89-DBN进行细胞放射性标记的效率如本表所示。细胞放射性标记效率在20%至50%之间，该数值为洗涤后放射性标记细胞沉淀中测得的未经校正产率。

本方案最关键的步骤是将 DFO-Bn-NCS 加入螯合混合物以及对放射性标记细胞的质量评估。该技术的应用将有助于理解基于细胞治疗药物的药代动力学，同时也将引发关于临床上是否需要改变细胞治疗清除特征的问题。