动态成像嵌合抗原受体T细胞与[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描
2022年2月17日
本方案描述了非侵入性追踪经基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞的方法学 体内 使用一种临床可获取的平台。
目前尚无经过临床验证的嵌合抗原受体T细胞成像平台。钠碘同向转运体（NIS）作为一种敏感且具有临床相关性的报告基因，可用于通过正电子发射断层扫描（PET）对CAR T细胞进行成像。利用TLP PET对表达NIS的CAR T细胞进行成像，可使研究人员无创地在体内追踪输注的细胞，并有望预测CAR T细胞治疗的疗效与毒性。
高效成像CAR T细胞有助于评估T细胞的迁移和扩增，并可推动克服现有局限性策略的开发。本方案所述方法简便，可应用于本研究中所示以外的其他CAR结构。首先采用标准密度梯度法从血液样本中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
为此，轻轻将15毫升密度梯度介质加入50毫升密度梯度分离管中，避免产生气泡。为防止细胞滞留，用含有2% FBS的PBS以1:1的体积比稀释血液样本，并小心地将稀释后的血液加至密度梯度介质上方，避免破坏两者的界面。然后在室温下以1,200 × g离心10分钟。
将上清液收集到一个新的50毫升锥形管中，用含有2% FBS的PBS洗涤细胞，加液至50毫升刻度线，然后在室温下以300 × g离心8分钟。弃去上清液，再将沉淀的细胞重悬于50毫升含2% FBS的PBS中。将沉淀的PBMCs重悬于含2% FBS的PBS中，调整细胞浓度至50 × 10⁶个细胞/毫升。
在新的50毫升离心管中重复洗涤步骤。计数细胞数量，然后在室温下以300 × g离心8分钟。进行T细胞分离时，将分离得到的外周血单个核细胞（PBMCs）转移至14毫升聚苯乙烯圆底管中。
然后使用阴性选择磁珠试剂盒，通过将外周血单个核细胞（PBMCs）置于阴性选择抗体混合液中，并在全自动细胞分离器中进行T细胞分离。T细胞分离后，计数细胞，并以每毫升2×10⁶个细胞的浓度将细胞接种于T细胞扩增培养基或TCM中进行培养。接着，轻轻旋转混匀含有抗CD3/CD28磁珠的小瓶，用移液器吸取所需体积的磁珠至无菌的1.5毫升微量离心管中。
洗涤时，将磁珠重悬于1毫升TCM中，然后将离心管置于磁力架上静置1分钟，吸除上清液。从磁力架上取下离心管后，将洗涤后的磁珠再次重悬于1毫升TCM中，并重复洗涤两次。将洗涤后的磁珠重悬于1毫升TCM中以转移至T细胞培养物中，随后用TCM将T细胞-磁珠悬液稀释至浓度为1.0 × 10⁶ 个细胞/毫升，再转移至经组织培养处理的6孔板中。
将培养板置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。为进行慢病毒转导，需在4摄氏度条件下解冻冻存的慢病毒，该病毒携带嵌合抗原受体或钠碘同向转运体。T细胞刺激24至48小时后，混匀T细胞以打散细胞团块，并以感染复数为5的比例将 freshly thawed 慢病毒加入细胞中。
将转导的T细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。孵育的第3、4、5天，计数转导的T细胞，并通过加入新鲜预热的TCM将细胞浓度调整至每毫升1.0×10⁶个细胞。对于携带嘌呤霉素抗性基因的NIS转导T细胞，在孵育的第3、4、5天，用浓度为每毫升1微克的嘌呤霉素二盐酸盐处理细胞。
第六天，将转导后的T细胞置于磁铁上一分钟，以打散T细胞簇并去除抗CD3/CD28磁珠。随后将收集的细胞重新放回培养体系中，细胞浓度为每毫升1.0 × 10⁶个细胞。用流式缓冲液洗涤含有50,000个细胞的T细胞培养等分试样，并用50 µL流式缓冲液重悬细胞。
为检测CAR表达，用一微升山羊抗小鼠抗体对T细胞进行染色。为排除死细胞，加入0.3微升LIVE/DEAD Aqua染料。将染色后的细胞在室温下避光孵育。
孵育15分钟后，在4°C条件下，以650 × g离心3分钟，用150微升流式缓冲液洗涤细胞。为固定并通透已染色的细胞，将细胞与100微升固定液在4°C条件下孵育20分钟。随后用含有皂苷等细胞通透剂的缓冲液洗涤细胞两次，每次100微升，并进行离心。
洗涤后，将透化的细胞重悬于50微升透化缓冲液中。然后加入0.3纳克抗人ETNL NIS抗体，在4摄氏度下孵育。孵育一小时后，加入150微升流式缓冲液洗涤细胞，并按所示方法进行离心。
然后在4°C条件下，将细胞与含有2.5微升抗兔二抗的50微升流式缓冲液共同孵育30分钟。按照前述方法洗涤T细胞后，将细胞重悬于200微升流式缓冲液中，进行流式细胞术检测。随后测定细胞的转导效率。
第8天，将T细胞在4°C条件下以300 × g离心8分钟，计数后用冻存液重悬细胞沉淀，细胞浓度为每毫升10 × 10⁶个细胞。将1毫升细胞悬液转移至每个已标记的冻存管中，于-80°C冰箱中保存48小时。48小时后，将T细胞转移至液氮中长期保存。
将注射了NIS阳性BCMA CAR-T细胞的小鼠进行PET/CT成像前准备，包括称重并去除金属耳标。随后通过尾静脉注射，向小鼠静脉内注射9.25兆贝可新鲜配制的F18四氟硼酸盐。经过45分钟的摄取期后，对麻醉状态的小鼠进行15分钟的静态PET图像采集，随后进行CT图像采集，旋转360度，共180个投影，持续5分钟。
在此代表性分析中，将两种病毒共转导至T细胞后，生成了NIS阳性的BCMA CAR T细胞，其中超过90%的细胞为NIS阳性。对T细胞从第0天至第8天的生长动力学分析显示，与未转导的细胞相比，导入BCMA CAR和NIS对T细胞扩增无显著影响。在对OPM-2细胞的流式细胞术分析中，经慢病毒转导并在嘌呤霉素处理后，细胞表现出GFP表达。
接受BCMA阳性且荧光素酶阳性的OPM-2细胞的小鼠进行了生物发光成像，以确认OPM-2细胞的植入情况。给予F18四氟硼酸盐的小鼠进行PET成像，结果显示NIS阳性的BCMA CAR T细胞在多个器官及骨髓中的分布。此外，从小鼠中分离的骨髓细胞显示OPM-2细胞已成功植入，并且NIS阳性的BCMA CAR T细胞已递送至骨髓。
为了获得高质量的灌注CAR T细胞成像，重要的是遵循NIS CAR T细胞生成方案的各个步骤，并确认存在双阳性NIS和CAR细胞组分。
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概述
本文介绍了一种详细的工程化嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术方案，使其表达钠碘同向转运体（NIS），从而可在临床前模型中利用[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描（[18F]TFB-PET）对CAR T细胞进行高灵敏度且具有临床相关性的成像。该方法可实现对CAR T细胞在体内的迁移、扩增和持久性进行无创追踪，有助于解决CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤中的关键挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫治疗
- 细胞成像
- 血液系统恶性肿瘤
背景
- CAR T细胞疗法在治疗B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤方面已显示出显著疗效。
- 由于CAR T细胞在体内的归巢、浸润和持久性较差，其临床应用受到限制。
- 细胞因子释放综合征和神经毒性等危及生命的毒性反应是重要的安全顾虑。
- 对CAR T细胞进行高效成像与追踪，对于评估治疗的有效性和安全性至关重要。
研究目的
- 建立一种将NIS整合到CAR T细胞中的方案，用于基于PET的成像。
- 实现对临床前模型中CAR T细胞的无创、高灵敏度追踪。
- 提供一种适用于多种CAR结构和靶基因的方法学。
使用的方法
- 采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
- 利用抗CD3/CD28磁珠通过阴性筛选磁珠法分离并扩增T细胞。
- 使用携带CAR和NIS结构的慢病毒对T细胞进行转导，并通过嘌呤霉素筛选NIS阳性细胞。
- 采用流式细胞术检测CAR和NIS的表达水平及转导效率。
- 工程化T细胞的冷冻保存。
- 将NIS阳性的CAR T细胞注射至小鼠体内，随后进行[18F]TFB-PET/CT成像以追踪细胞分布情况。
主要结果
- 高效的共转导产生了NIS阳性BCMA CAR T细胞，NIS表达率超过90%。
- 与未转导的对照组相比，NIS和CAR的引入对T细胞扩增未产生不利影响。
- PET成像显示了NIS阳性CAR T细胞在小鼠各器官及骨髓中的分布情况。
- 骨髓分析证实了OPM-2肿瘤细胞的植入以及NIS阳性CAR T细胞的成功递送。
结论
- NIS 可作为 CAR T 细胞 PET 成像的敏感且具有临床相关性的报告基因。
- 该方案可实现对 CAR T 细胞迁移和扩增的无创、活体追踪。
- 该方法可适用于其他 CAR 结构和靶基因，有助于推动其在免疫治疗研究中的更广泛应用。
常见问题
行业重要性概述
无创、定量的CAR T细胞迁移和存续成像技术通过实现对体内行为的实时评估，解决了细胞治疗开发中的一个关键瓶颈。基于NIS的PET/CT成像技术的整合，为细胞分布、扩增及植入提供了具有可操作性的洞察，支持在关键的发现和转化转折点上建立预测信心。该能力增强了下一代免疫疗法在风险调整基础上的决策制定和项目优先级排序。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在临床前模型中直接可视化CAR T细胞的迁移和肿瘤浸润过程。
- 通过确认工程化构建体在体内的持续存在和扩增，支持其功能验证。
- 通过将细胞定位与治疗效果相关联，有助于阐明作用机制并降低研发风险。
筛选与检测方法开发
- 为评估针对多个靶点的CAR T细胞构建体提供标准化的成像读出。
- 实现对细胞分布和扩增的可重复定量，用于比较筛选。
- 支持在转化工作流程中进行细胞追踪和生物分布研究的检测方法开发。
转化与临床前研究
- 将临床前成像结果与细胞治疗项目的转化生物标志物策略相整合。
- 通过在体追踪细胞命运，实现从发现到临床前验证的连续性研究。
- 提供疗效和潜在毒性的早期指标，为风险调整后的推进决策提供依据。
流程与工作流整合
该成像方法通过实现对体内工程化细胞治疗的无创、定量追踪，连接了早期发现、先导优化和临床前验证阶段。
- 发现生物学：支持对CAR T细胞的转运、存续及肿瘤靶向性的假设验证。
- 筛选：提供定量、可重复的成像结果，用于CAR结构的比较与优化。
- 分析：基于PET/CT提供细胞定位与扩增的测量数据，支持数据驱动的决策制定。
- 转化研究：将临床前成像数据与细胞治疗项目的临床生物标志物策略相衔接。
- 企业级复用：提供模块化成像平台，可适配多种CAR结构及靶基因。
运营与企业影响
- 科学价值：通过实现体内实时追踪，提高对细胞治疗有效性和安全性的预测可信度。
- 操作价值：标准化成像工作流程，确保在不同项目间的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：提供早期可操作的读数，从而优化决策流程和资本配置。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的细胞治疗候选项目的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备基因工程、细胞培养和PET/CT成像技术方面的专业知识。
- 需要具备放射化学设施以进行[18F]TFB的制备，以及相应的成像设施。
- 需要建立标准化的细胞工程和成像操作流程，以确保实验的可重复性。
- 可根据需要调整实验方案，适用于多种CAR结构和靶基因。
- 依赖于临床前模型的适用性以及针对特定研究问题的成像灵敏度。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:02
Ex Vivo T Cell Isolation from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)
2:47
T Cell Stimulation and T Cell Expansion
3:54
Transduction of Lentiviruses on Stimulated T Cells
5:10
Surface Staining of B Cell Maturation Antigen (BCMA)-CAR Using Goat Anti-Mouse IgG (H+L) and Intracellular Staining of NIS Using Anti-Human ETNL NIS
7:18
NIS+BCMA-CAR T Cell In Vivo Imaging Using BCMA+OPM-2 Xenograft Mouse Model
7:57
Results: T Cell Growth Kinetics and In Vivo Cell Trafficking Assay
9:08
Conclusion
![自动化的放射化学合成[18F]3F4AP：一种用于成像脱髓鞘疾病的新型PET示踪剂](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F55537.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.884Z&w=384&q=75)
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