工业化的、人工智能引导的激光显微切割技术用于肿瘤微环境的微尺度蛋白质组学分析

该方案结合了由人工智能驱动的图像分析技术，用于组织分割。通过激光显微切割实现组织学选择性采集，使我们更接近病理组学（Pathomics）的实现。利用人工智能预先定义组织感兴趣区域（ROI），可缩短组织切片在常温下的暴露时间，减少执行此类采集所需的人力，并降低操作者间的差异性。

该技术广泛适用于任何涉及从组织样本中收集或富集特定细胞群体的疾病或病理学相关研究。对于具备基本组织病理学知识和激光显微切割（LMD）操作经验的用户而言，该方法操作简便。关键在于确保为细胞切割出清晰的校准区域，并对分类器进行充分训练。

首先，在切割参考校准标记点之前，确保载玻片完全干燥。打开激光显微切割软件，在“导入形状”选项下打开默认的校准点 sld 文件。将载玻片加载到仪器上，组织面向下，标签侧靠近操作者。

将载玻片放入激光显微切割平台的载片架中，选择“切割前自动聚焦”选项。使用激光显微镜及默认校准点 sld 文件，在 PEN 膜上切割出校准标记。仅针对激光显微切割富集样本的情况，打开图像分析软件。

选择打开的图像，在弹出窗口中选择由切片扫描生成的点 svs 图像文件。进入注释标签页，选择并使用矩形注释工具在组织周围绘制一个方框。选中该方框注释后，在图像上单击右键。

选择高级下拉菜单，然后点击分区选项。将瓦片大小和间距分别设置为 500 和 40，选择确定以生成瓦片。选中并删除用于生成瓦片的周长框注释。

选择图层操作下拉菜单，然后单击导出，将平铺注释保存为点注释文件。将已保存的 Python dapa 算法副本放入与平铺注释文件相同的文件夹中，该算法用于合并人工智能分类的注释图层。复制平铺注释文件的名称。

使用 idle 集成开发环境打开 Python 程序，并将平铺注释文件的名称粘贴到程序底部的引号之间。选择运行下拉菜单，然后单击运行模块。等待一段时间，程序将生成若干文件，这些文件会将所有平铺注释合并到单个图层下。

打开图像分析软件并进入注释选项卡。选择图层操作下拉菜单，然后点击删除所有图层以从图像中移除所有注释。再次选择图层操作下拉菜单，然后点击导入本地注释文件。

在弹出窗口中，选择由脚本生成的合并后的点注释文件。确保所有导入的图块均位于同一注释层下。在分类器选项卡中，按照制造商的说明，标出肿瘤、间质以及空白玻片背景 ROI 的代表性区域。

运行分类器之前，单击“高级分类器选项”，在“注释”选项卡中勾选ROI框或多个框以选择所需的注释层。通过分类器操作菜单中的“注释层”选项来运行分类器。分类器分析完成后，转到“注释”选项卡，选择由该分析生成的注释层。

选择图层操作下拉菜单，然后单击“删除当前图层以外的所有图层”，以从图像中移除所有其他标注图层。接下来，再次选择图层操作下拉菜单，然后单击“导出”，将标注保存为点标注文件。为会话或项目创建一个文件夹，并将点标注文件保存在该文件夹的子文件夹中。

使用载玻片的唯一标识符进行标记。进入注释选项卡，选择图层操作下拉菜单，然后点击删除所有图层，以移除图像中的全部注释。选择画笔工具，并从每个校准标记点绘制一条短线。

按以下顺序从标记处绘制线条：左上、右上、右下。选择图层操作下拉菜单，然后点击导出，将拼接注释保存为 do 注释文件。

在文件名中添加下划线“calib”，并将文件放入包含拼接图形坐标的子文件夹中。复制主项目的地址。使用 Idle 集成开发环境打开 XML 导入生成脚本 malliator，然后将项目文件夹地址粘贴到脚本末尾的引号之间。

选择运行下拉菜单，然后单击运行模块以执行脚本。将标记好的膜玻片加载到激光显微镜载物台的玻片架上，组织面向下，标签侧靠近操作者。从文件下拉菜单中选择导入形状。

选择为该玻片生成的点阵XML或LMD导入文件。在弹出窗口中选择“否”，以避免从文件加载参考点；在第二个弹出窗口中也选择“否”，以避免使用任何先前存储的参考点进行校准。根据激光显微切割应用程序的提示，将校准十字依次对准玻片上的三个校准标记点。

在载玻片图像的左上角、右上角和右下角寻找校准标记。在图像分析软件中，这些标记对应显微镜载物台上倒置激光显微切割载玻片的参考点。使用5x物镜定位，切换至63x物镜对每个校准标记进行对齐。

在弹出窗口中选择“否”，以避免将参考点保存到文件中；在第二个弹出窗口中选择“确定”，确认载玻片已插入。将5倍物镜移至工作位置，并在弹出窗口中选择“是”，以使用实际放大倍数。导入的图形出现后，调节摄像头对准组织样本。

在形状列表窗口中高亮并选中所有形状。使用视野内的一个或两个标注作为参考，将它们拖动到相应位置，并将激光切割的垂直 z 轴对齐。将试管装入专为 PCT 微管设计的通用试管架中。

检查导入的图形，并将其分配至相应的收集管位置。按下“开始切割”以启动激光。卸下含有LMD组织的样本管并盖紧，置于干冰上。

经过热循环和离心后，将LMD收集的组织样本从PCT微管中取出，并移除且丢弃微帽。加入胰蛋白酶，按每30平方毫米组织加入一微克的比例添加。然后使用微帽工具将微型研磨杵插入微管中。

将微量离心管放入桶循环卡盒中，并组装完整的卡盒。将卡盒放入桶循环压力室，盖紧盖子。在50摄氏度条件下，以45,000 PSI压力循环50秒，随后在常压下保持10秒，共进行60个循环。

进行液相色谱-质谱分析时，将自动进样瓶装载到液相色谱自动进样器的相应位置。关闭自动进样器，并使用适当的梯度和质谱方法分析各个组分。采用变异程度最大的100种蛋白质进行无监督层次聚类分析。

通过激光显微切割富集及全肿瘤样本，实现了高级别浆液性卵巢癌与卵巢透明细胞癌组织学类型的分离。相比之下，来自高级别浆液性卵巢癌和卵巢透明细胞癌的激光显微切割富集间质样本则聚类在一起，并独立于激光显微切割富集的肿瘤样本及全肿瘤样本。

在定量的 5,971 种蛋白质中，高级别浆液性卵巢癌与卵巢透明细胞癌组织样本的全肿瘤集合之间有 215 种蛋白质发生了显著改变。Hughes 定量的 76 种特征性蛋白质中，有 57 种在此数据集中被共同定量，并显示出高度相关性。训练分类器是最具挑战性的部分。根据 Indica Lab 软件的操作说明优化分类器，可获得最准确的结果。

其余所有步骤均实现标准化。利用此由人工智能驱动的激光显微切割工作流程所获取的组织，可兼容多种下游分析应用，包括本文所述的基于质谱的蛋白质组学分析，或基因组学、转录组学及其他组学分析。