结直肠癌细胞三维模型中侵袭性肿瘤微环境的分子谱分析 离体 成纤维细胞

本实验的总体目标是表征侵袭性肿瘤前沿处恶性上皮细胞与癌相关间质细胞之间界面的独特生物学特性。首先通过建立结肠种植组织来源的原代成纤维细胞培养来实现这一目标；第二步是利用原代结肠成纤维细胞与培养的结直肠癌细胞构建器官型共培养模型。

接下来，将类器官模型用福尔马林固定，切片后置于膜载玻片上，并用结晶紫染色。最后一步是激光显微切割，以分离侵袭性肿瘤细胞与非侵袭性肿瘤细胞以及癌症相关间质细胞。最终，可采用分子谱型分析技术来表征侵袭性与非侵袭性肿瘤细胞及其周围肿瘤微环境中间质细胞的生物学特性。

当我们意识到在结直肠癌的三维类器官共培养模型中，侵袭性细胞与非侵袭性细胞之间的区别非常清晰时，我们首次提出了该方法的构想。首先，直接从实验室的外科手术室获取正常人结肠黏膜组织样本。将一份标本置于10厘米组织培养皿的中央，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，PBS中需添加青霉素、链霉素和抗真菌剂（fungi zone）。

最后一次洗涤后不要吸除液体，使用无菌镊子和手术刀将组织切成小块。然后将每一块组织放置在用手术刀划出的十字线中心位置。在12孔板中，轻轻晃动手术刀，使组织贴附于培养表面。

将标本置于750微升的原代成纤维细胞生长培养基中，培养基应浸没组织，但不能使其漂浮。随后将标本放入37摄氏度、5%至10% CO2的培养箱中培养，持续5天。大约7天后，成纤维细胞将开始从组织边缘缓慢向外生长。

大约三到四周后，这一现象将更加明显。如果已有足够数量的成纤维细胞生长出来，在细胞脱离后，向每个孔中加入 750 微升胰蛋白酶，然后将细胞转移至 T25 组织培养瓶中，用于制备含成纤维细胞的组织型凝胶。首先，用添加了补充物的 dmm 制备成纤维细胞悬液，每凝胶含 500,000 个细胞。

在冰上按照文本方案中所述比例制备九份凝胶，每份凝胶体积为一毫升。共准备十毫升，轻柔混匀以避免产生气泡。随后将一毫升混合液加入24孔板的每个孔中，在37摄氏度、湿润的环境中孵育一小时。

凝胶放置一小时后，每孔加入一毫升含补充物的DMEM培养基，然后放入培养箱中过夜。次日，吸去凝胶表面的培养基，在涂有凝胶的尼龙膜上接种一毫升含有500,000个结直肠癌上皮细胞的培养基。

使用无菌镊子预先准备好尺寸为 1.5 厘米 × 1.5 厘米的无菌尼龙膜。将所需数量的尼龙膜放入一个 10 厘米的培养皿中。按照文本方案所述，在冰上制备凝胶混合液，并向凝胶混合液中滴加 0.1 摩尔的氢氧化钠，直至溶液变为粉红色，表明溶液已中和。

然后将 250 µL 该溶液加入每张尼龙膜上。随后在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育 30 分钟，使凝胶固化。接着向每个 10 cm 培养皿中加入 10 mL 用 PBS 配制的 1% 戊二醛溶液。

凝胶凝固后，先在4°C下孵育1小时，然后用PBS洗涤尼龙膜三次，再用添加补充物的DME洗涤一次。将膜在相同缓冲液中于4°C下过夜孵育，以使类器官凝胶升至已灭菌的支架网格上，这些支架网格由不锈钢片折叠成三脚架结构制成。随后用已灭菌的镊子和乙醇将每个钢网放置到六孔板的各个孔中。

将胶原层面朝上的凝胶包被尼龙膜放置于每个网格上。使用经乙醇灭菌的刮铲，小心地将24孔板中的类器官凝胶转移至抬高的尼龙膜上。向孔中加入含补充物的DMEM培养基，直至尼龙膜与培养基接触但未浸没。

确保培养基不接触器官型凝胶。在37摄氏度、5%CO2的湿润环境中孵育14天，每两天更换一次培养基。

取出包含尼龙膜的整个类器官组织，将其放置在保鲜膜上。使用洁净的一次性手术刀将类器官组织及尼龙膜沿中线切开，将两半均置于甲醛中固定24小时。室温下，24小时后将甲醛替换为70%乙醇，过夜放置，随后进行石蜡包埋、切片和染色，以进行激光显微切割。

第一部分，将组织切片切割至10微米厚度，并置于膜上固定的载玻片上。按照文本方案中所述处理切片后，准备使用选定的平台进行激光显微切割。将带有染色切片的玻片放置到显微切割仪器中。

将0.5毫升微型离心管倒置安装在显微镜载物台上，并向管盖中加入50微升细胞裂解缓冲液，用于在直视下收集显微切割的组织。使用操纵杆定位目标组织，并通过软件界面标注染色的组织切片，标记肿瘤浸润前沿需要进行显微切割的细胞区域。启动激光指令，激光将切割所标记的区域，并将显微切割的组织弹射至微型离心管的管盖中。

采用适当方法继续处理样品，以提取目标分析物。此处展示的是SW 480结肠直肠癌细胞侵入类器官间质的激光显微切割图像。使用结晶紫对结肠直肠癌上皮细胞进行染色以突出显示。

在进行激光切割之前，首先界定侵袭性肿瘤岛，随后将切割下的组织片段转移至收集装置。使用相同方法识别并分离非侵袭性细胞和间质细胞。通过microRNA表达谱分析三维共培养体系，以比较位于侵袭性肿瘤前沿的细胞与分层肿瘤区域细胞之间差异表达的microRNA。

数据根据全变化以及数据值上下两倍进行排序。展示了一个代表性实验的变化结果，显示侵袭边缘细胞与非侵袭边缘细胞之间微小RNA基因表达的差异。观看本视频后，您应能充分了解如何构建解剖学上合理的类器官模型，以及如何利用激光显微切割技术分离特定细胞群体以供进一步研究。哇。