创建用于模拟关节疾病与药物测试的膝关节芯片模型

由于缺乏与生理情况相关的临床前模型，目前在临床试验中准确预测人类对药物反应的能力十分有限。该微生理系统可解决这一差距。这种源自人体细胞的系统能够准确模拟人类膝关节骨关节炎的整体疾病特征，从而可在临床试验前对治疗骨关节炎的疾病修饰类药物进行测试，有望节省数百万美元。

通过将17克B型明胶加入500毫升蒸馏水中开始制备甲基丙烯酰化明胶（GelMA）。在37摄氏度摇床中混合30分钟，然后加入13毫升甲基丙烯酸酐，并在摇床上过夜混合。次日，将GelMA分装至透析袋中，每份约60毫升。

将所有透析袋放入含有搅拌子的蒸馏水中，4 摄氏度下透析七天。每天多次更换蒸馏水，并在过夜时保持透析袋处于 4 摄氏度环境中。第七天，将 GelMA 倒入培养皿中，于 -80 摄氏度冷冻，随后进行冻干。

然后，将 GelMA 置于冻干机的真空室中进行冻干。在从冻干机中取出前，确保其完全干燥。接着，将冻干后的 GelMA 溶解于 Hanks' 平衡盐溶液中，浓度为 15%，并使用少量氢氧化钠调节 pH 至 7.4。

根据所获得的体积，向溶液中添加抗生素-抗真菌剂和0.15%苯基磷酸锂，或LAP。避光保存GelMA溶液，并于-20摄氏度储存至后续使用。将3D打印的双流生物反应器腔室、盖子和插入件装入灭菌袋中，于121摄氏度蒸汽条件下高压灭菌20分钟。

然后，用干热处理20分钟。灭菌后，在生物安全柜内将生物反应器腔室、盖子和插入物浸泡在15毫升无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中过夜，随后完全干燥。使用1000微升移液器，将每毫升含20 × 10⁶个人类骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的细胞重悬于15% GelMA溶液中，吹打混匀20次。

然后，使用无菌手套将一个无菌、干燥的硅胶模具压在培养皿上。用镊子将一个插入物放入硅胶模具的每个孔中，插入物的孔面朝下。完成后，使用200微升移液器向每个插入物中加入约50微升细胞悬液。

将凝胶插入物的顶部暴露于395纳米波长的紫外手电筒照射1.5分钟，然后另一侧照射30秒，以实现凝胶在插入物内的交联。使用无菌镊子立即将插入物转移至非组织培养六孔板中含8毫升生长培养基的孔内，让细胞过夜恢复。为启动脂肪组织分化，将插入物转移至含8毫升成脂诱导培养基的孔中，每日更换培养基，培养28天。

为了构建骨软骨单元，将插入物放入双流生物反应器腔室中，盖上孔盖，并分别以每分钟5 µL的流速向其中灌注35 mL成骨培养基和35 mL软骨诱导培养基。通过每两周更换一次相应类型的培养基，维持细胞分化培养28天。为了获得成纤维细胞，将MSCs在含有20 mL成纤维诱导培养基的T150 cm²组织培养瓶中进行二维培养，持续21天。

每周定期更换培养基。21天后，使用4毫升胰蛋白酶消化以分离细胞。将3D凝胶包埋于插入物内。

为了获得类似滑膜的纤维组织（SFT），请遵循类似的方案。将内径为0.062英寸、外径为0.125英寸的硅胶管一端连接至微型关节生物反应器杆，另一端连接F 1/16英寸鲁尔锁接头。然后，将3D微型关节生物反应器连同硅胶管和盖子一起进行高压灭菌。

将35毫升用于迷你关节培养的培养基制备并加入培养基储液槽中。使用直镊子将骨软骨单元从双流生物反应器转移至迷你关节生物反应器的右侧孔中。在用无菌盖板盖住所有孔之前，将脂肪组织插入物和纤维组织插入物分别转移至左侧和中间孔中。

将迷你连接夹的入口端连接至培养基储液池，出口端连接至注射器。然后将注射器安装到注射泵上。将注射泵和芯片转移至培养箱中。

将培养基储液器置于培养箱外的冰上。将泵设置为抽取模式，将培养基从储液器抽入微型关节生物反应器腔室中。继续此微型关节培养过程28天。

为了模拟关节炎症和软骨退化，将白细胞介素-1β以每毫升10纳克的浓度加入成纤维性培养基中，持续处理7天。在第3天更换新鲜的白细胞介素-1β时，务必更换移液器吸头。在药物测试中，经过3天的白细胞介素-1β处理后，可将药物加入共用培养基中，以模拟关节内给药；或者将药物加入所有类型的培养基中，以模拟全身性给药。

经过七天的白细胞介素-1β处理后，收集各个组织用于分析。使用无菌镊子移除插入物后，将活检打孔器穿过插入物中心以取出凝胶，并将凝胶置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。接下来，在检测基因表达的同时，将骨软骨凝胶切成两半。

从每种培养基来源收集约1.5毫升培养液，在14,000 G条件下离心10分钟。弃去沉淀后，将条件培养基在液氮中迅速冷冻。对于组织学染色和免疫染色，首先将骨软骨及类滑膜纤维组织（SFT）样本用10%缓冲福尔马林固定，然后用浓度递增的乙醇进行脱水。

用二甲苯清除样品，将其包埋于石蜡中，最后将样品切成六微米厚度的切片。对于脂肪组织，可直接用油红O溶液或BODIPY对10%缓冲福尔马林固定的样品进行染色。各个微组织的组织特异性表型均得到了良好维持。

培养28天后，收集了迷你关节的所有组织以分析其表型。骨软骨单元微组织的骨性部分高表达骨钙素。在骨软骨的软骨部分，组织显著高表达II型胶原和聚集蛋白聚糖。

代表性脂肪生成基因、脂联素和瘦素在脂肪组织中的表达水平较高。钙盐沉积、碱性磷酸酶以及骨钙素蛋白主要见于骨软骨微组织的骨部。骨软骨组织的软骨侧显示出良好保留的糖胺聚糖和II型胶原。

培养28天后，与软骨细胞肥大相关的标志物——II型胶原和印度刺猬蛋白的表达显著下调。在脂肪组织中发现大量脂滴沉积。免疫荧光染色显示，培养四周后SFT表现出强烈的润滑素和钙黏蛋白11表达。

在疾病模型中，IL-1β 处理导致 SFT 中细胞凋亡以及 MMP-13 水平升高。IL-1β 处理引起软骨降解，提示骨软骨组织与 SFT 之间存在串话。通过全身给药的萘普生治疗在 IL-1β 微关节中显示出减轻软骨降解的治疗效果。

实时PCR结果表明，四种潜在的骨关节炎疾病修饰药物部分逆转了软骨丢失。该实验最关键的步骤包括在插入物中对凝胶进行交联，以及将插入物放置到生物反应器中。该芯片可用于研究骨关节炎中其他风险因素的作用，例如肥胖和机械性损伤。

它也可用于研究其他关节疾病。