小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

本方案可用于骨髓造血干细胞和祖细胞以及骨髓基质细胞的表型分析。该方法可用于研究在不同条件下这些细胞群体的变化。与其他已报道的方法相比，该技术能够对造血细胞进行表型分析，特别是针对骨髓的两个功能性区域——骨内膜区和中央骨髓区，以及骨髓基质细胞。

首先，将已处死的动物仰卧放置于培养皿中，并用70%乙醇喷洒。使用剪刀在腹部上方剪开切口，将皮肤一直剥离至踝部。抓住其中一条腿，用剪刀在其底部剪断，将其从动物体上分离。

然后在踝关节处剪切，将足部从腿部移除，并将腿部置于冰上预冷的含2% FBS的PBS中。接着用镊子夹住髋骨，使用剪刀在其后方剪切，将其从动物体上分离。将髋骨置于冰上预冷的含2% FBS的PBS中。

将腿骨和髋骨放入培养皿后，使用无菌手术刀清洁骨骼。然后用手术刀在膝关节处切割，分离胫骨和股骨，并将清洁后的骨骼置于含2%FBS的冰浴PBS中。将股骨或胫骨放入研钵中，加入含2%FBS的冰浴PBS，用研杵轻轻按压骨骼使其紧贴研钵壁，从而粉碎骨骼。

接下来，使用10毫升移液器将所得的细胞悬液上下吹打，以混匀，并通过置于管口上方的40微米细胞筛网将其转移至50毫升离心管中。用更多含有2% FBS的PBS冲洗研钵，并将冲洗液通过同一40微米细胞筛网转移至同一50毫升离心管中。将50毫升离心管在4摄氏度下以500 ×g离心5分钟。

弃去上清液后，于室温下用移液器反复吹打数次，将细胞沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。室温孵育2分钟后，加入15毫升含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS 2%FBS），并将50毫升离心管离心。若细胞沉淀无明显红色，则弃去上清液，将沉淀重悬于200微升含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS 2%FBS）中，随后将细胞悬液转移至96孔V型底板的一个孔中进行染色。

按照之前演示的方法将骨组织研碎后，用剪刀剪去P1000移液枪枪头的尖端，用其将研钵中的全部内容物转移至一个50毫升离心管中。随后在4°C条件下以500 ×g离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于3毫升胶原酶IV和分散酶II溶液中。

将试管在 37 摄氏度下孵育 40 分钟。用含 2% FBS 的 PBS 补充至 25 毫升，并涡旋混匀。接着，通过 100 微米细胞滤筛将内容物转移至新的 50 毫升试管中。

然后向旧的50毫升离心管中加入15毫升含2% FBS的PBS，并通过100微米细胞滤筛将溶液转移至新的50毫升离心管中。离心后弃去上清液，用移液器反复吹打数次，将细胞沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。室温孵育2分钟后，加入15毫升含2% FBS的PBS。

再次离心试管，弃去上清液后若细胞沉淀无明显红色，则将沉淀重悬于 200 µL 含 2% FBS 的 PBS 中，并将细胞悬液转移至 96 孔 V 型底板的一个孔中进行染色。随后在 4°C 条件下以 500 ×g 离心 3 分钟。将股骨置于培养皿中，使用无菌手术刀切除骨的两端。

然后使用无死体积的0.5毫升胰岛素注射器，从骨的两侧各一次将100微升含2%FBS的PBS穿过骨内部，冲洗骨的中央部分，并将冲洗液收集至含有1毫升含2%FBS的PBS的微量离心管中。随后将细胞悬液转移至一个已标记为“冲洗后骨髓”的50毫升离心管中，该管内含有4毫升含2%FBS的PBS。在研钵中用预冷的含2%FBS的PBS，借助研杵轻轻按压骨的两端使其与研钵壁摩擦，从而将骨端压碎。

待细胞悬液充分匀浆后，通过40微米细胞滤筛将其转移至已标记为“破碎骨髓”的50毫升离心管中。最后，用更多含2% FBS的PBS冲洗研钵，并将冲洗液转移至同一离心管中。对健康年轻成年C57BL6J小鼠的全部骨髓样本进行了造血干细胞和多能祖细胞的流式细胞术分析。

在分析总骨髓中的基质细胞、内皮细胞和间充质干细胞时，可根据瘦素受体（leptin receptor）的表达来明确识别间充质干细胞，而内皮细胞则可根据CD31和SCA-1的表达进行识别。通过流式细胞术分析总骨髓中的内皮细胞，可依据ICAM1的表达区分小动脉内皮细胞与窦状内皮细胞。对中央区和骨内膜区骨髓组织中动脉性和窦状骨髓内皮细胞的定量分析显示，动脉性骨髓内皮细胞在骨内膜区域更为丰富，而窦状结构则更多见于中央骨髓区域。

在获取灌洗骨髓时，通过骨中央部分内腔的含2%FBS的PBS的体积或次数不应超过所述指示量。将本方法与经表型分析的细胞群体的功能检测相结合，可进一步提供有关在研究条件下这些细胞群体可能发生的改变的宝贵信息。本方案可实现对骨内膜区和中央骨髓中造血细胞的差异性表型分析，使研究人员能够探究在这些特定骨髓区域中可能特异性发生的造血功能紊乱。