未脱钙骨组织切片中造血细胞与基质细胞相互作用的自动化定量分析

本实验的总体目标是定量分析骨髓中特定细胞亚群之间的相互关系。首先，从小鼠股骨肿瘤中获取组织学冷冻切片；其次，对切片进行免疫荧光染色，随后采集共聚焦图像以进行分析。

随后对图像进行数字化分析。最终，可通过模拟不同类型细胞的位置，来计算特定免疫细胞与其微环境之间相互接触的速率和频率。我们最初是在分析骨髓中长寿命浆细胞的微环境生态位时产生了这一方法的想法，当时迫切需要一种能够明确量化骨髓组织内细胞间关联的方法。

RA Maya 将为您演示从成年小鼠中通过冷冻吸管获取股骨的操作步骤。首先，将配备硬组织刀片的标准切片机的样品和刀片温度设置为零下24摄氏度。经过15分钟的适应后。

使用冷冻包埋介质将样本块固定在金属样本托上，并根据需要调整样本块的方向。修块至骨组织完全暴露且骨髓可见为止。然后将切片厚度调整为七微米。

接着，使用包有脱脂棉的木制刮刀将一段 Kawamoto 粘性胶带的黏面朝下固定在样品块的顶部，用镊子对样品进行切片。翻转胶带，使切片位于上方。然后将胶带转移至玻璃载玻片上。

当收集完最后一个切片后，用透明胶带将胶带固定在玻璃载玻片上。让样本干燥至少30分钟，并将载玻片储存在负80摄氏度条件下。两名女性研究人员根据常规免疫荧光染色方案对解冻的冷冻切片进行染色成像。

确保包含核染色以观察组织完整性。切片染色后，在每个样本上加入一滴封片剂，然后在激光扫描共聚焦显微镜上加盖一张1号玻璃盖玻片。选择20倍物镜，设定视野为708.15 × 708.15 微米。

然后以每幅图像 2048 × 2048 像素逐个成像样品，以确保结果具有可比性。使用一个通道记录基质结构的图像，一个通道记录细胞核，根据需要另设额外通道记录目标造血细胞。采用行平均法进行图像采集。

理想情况下，拍摄单个相邻图像以覆盖整个股骨切片区域，然后将图像保存为显微镜图像文件格式。随后，对每个成像区域的每个通道分别导出一张 JPEG 文件，并使用图像分析工具对共定位和邻域分析进行图像分割定量，再进行随机细胞模拟实验。

针对每张待模拟的骨髓图像，在分析的骨髓图像上进行定位。将细胞接触工具提供的单个CSV文件、原始DPI通道JPEG文件以及原始基质通道JPEG文件放置于同一个文件夹中，以对来自单个股骨样本的一系列图像执行批量模拟。同时，将所有原始JPEG文件及其对应的单个CSV文件一并转移至另一个文件夹。

当所有文件组装完毕后，启动模拟工具，然后勾选自动加载图像数据选项。启用此选项后，将自动打开与已分析图像对应的 CSV 文件。

接下来，输入 CSV 文件的公共标签以及用于批量模式模拟的图像集数量。然后加载由 S stroma 通道生成的 JPEG 文件，该文件的文件名以数字 3 结尾，以生成 DPI 通道的掩膜。勾选“应用掩膜”复选框，并将 DPI 图像转换为二值掩膜的阈值设置为 10。

勾选八位和膨胀框，并将膨胀等级设置为5像素。然后勾选宽度腐蚀框。接着输入用于分析模拟图像的邻域半径的期望值，勾选使用OSU框以采用OSU算法自动检测造血细胞的基质结构。

模拟为圆形。使用任何包含适当对象分割功能的图像分析软件，测量所分析细胞类型的细胞大小分布，并根据这些测量结果确定所有造血细胞类型的 sigma。可确定细胞大小的截断值，即以像素为单位的直径，用于描述图像分析工具仍能识别为完整细胞的最小对象。

然后输入用于模拟红色、绿色和蓝色细胞大小分布的细胞大小截断值以及以像素为单位的 sigma 值。接下来，在“细胞与掩膜”选项卡中，勾选“删除”复选框，以便在细胞与掩膜中禁入区域的至少一个像素重叠时，允许程序为该细胞选择新的位置。在“细胞排斥”选项卡下，同时勾选“避免细胞重叠”选项。

然后输入两个细胞中心之间允许的最小距离（单位：像素）。如果重叠由一个细胞中心到另一个细胞中心的最小距离定义，则将最大重叠面积设置为100%。接着将模拟工具设置为1000次重复。然后勾选自动保存选项，以将每次重复模拟对象的坐标保存为文本格式的.wreck文件，用于批次中每幅图像的所有重复。

同时为保存的文件输入一个常用的标签。最后，点击运行模拟，确定每组对应于各记录图像的1000张模拟图像的平均接触频率和邻近频率。为此，将平均接触次数和邻近次数除以每张图像中记录的细胞数量，并将所得频率与记录图像的自动共定位分析结果进行比较。

在此图中，展示了利用荧光嵌合骨髓对嗜酸性粒细胞、浆细胞和B细胞在基质细胞微环境中的定位分析。由细胞接触和邻近分析工具生成的CSV文件包含每种细胞群体的细胞计数、以像素为单位的总面积，以及接触或邻近计数。在进行细胞随机定位模拟之前，需先确定描述细胞大小分布的参数，该分布符合高斯分布；在此模拟中，三种细胞群体测得的sigma相对值保持不变。

尽管以像素为单位定义的Sigma值被设定为与记录细胞的视觉外观相匹配，以确定细胞可被放置的区域，但仍从DAPI通道生成了掩膜。随后确定10为生成二值图像的最佳密度阈值。接着按预期检验了浆细胞、嗜酸性粒细胞或B细胞与基质细胞接触的相关性。

这些分析结果显示，与模拟结果相比，记录图像中浆细胞与B细胞的接触率显著更高。相反，嗜酸性粒细胞与基质细胞的接触则未观察到明显差异。该方法有助于回答免疫学、血液学、病理学或干细胞生物学等任何需要分析骨髓复杂组织结构领域的关键问题。