硬骨鱼类模型日本青鳉（Oryzias latipes）的精子采集与计算机辅助精子分析

该技术能够对小型模式鱼——日本青鳉的精液进行取样，并以一致的方式评估其质量。具体而言，通过腹部按摩采集精子，可在同一条鱼上进行多次取样，因为该方法具有非侵入性。此外，该技术还可用于青鳉精子的冷冻保存。

精子质量是受精成功率的重要指标，因此在生态学和整体生理学研究中是一项关键的分析参数。首先，准备一块柔软的固定海绵，将其裁剪至恰好能紧密贴合于培养皿内。在海绵中央切一条直线切口，长度足以将鱼体腹面朝上固定其中。

将鱼麻醉后，用纸巾轻轻擦拭鱼的腹部使其干燥。将鱼腹面朝上放置在湿润的固定海绵的凹槽中，使鱼的鳃部暴露于海绵中的麻醉溶液。如果泄殖腔周围潮湿，可用一次性擦拭纸巾轻轻擦干腹部下方。

在解剖显微镜下，将连接有吸管的微量移液器紧贴鱼的泄殖腔。然后用钝头光滑镊子沿从头侧到尾侧的方向轻轻挤压腹部，进行按摩。为回收该鱼，先将其从海绵中释放至预先准备好的恢复用水中，然后再将其放回水族系统。

将收集的精液转移至含有预热激活液的离心管中，使用吸移管组件将溶液上下吹打数次。在分析前轻轻弹击离心管，使稀释后的精子轻柔混匀。处死鱼类后，按先前所示方法将其干燥，并将鱼置于解剖显微镜下，使其左侧面向上。

使用小型解剖剪，从泄殖腔开始沿背部剪开一个皮瓣，然后沿肋骨剪至鳃部，以暴露内部器官。找到睾丸后，用精细镊子剪断其两端的附着组织。取出睾丸并转移至预先准备好的含有预热激活液的离心管中。

用镊子将睾丸在管壁上反复碾压数次，以释放精子，此时溶液会呈现轻微浑浊，可凭肉眼观察到。开始分析前，打开精子分析软件并选择运动能力分析模块。在软件中设置所有参数的配置。

将预热的一次性20微米计数板置于显微镜载物台上，载物台温度设置为27摄氏度。用移液器将样品加入计数板的计数室中，直至充满为止，但避免过度填充。小心擦拭计数室入口处多余的样品，以防止溶液中细胞发生漂移。

选择“分析”以在显微镜下观察样本。确保显微镜已聚焦，然后再次选择“分析”以记录视野中的精子。将载玻片移动至样本的新区域，重复此操作，共采集三到五个不同的视野，避免气泡、细胞团块或人为假象。

要查看结果，请选择结果，然后双击某个区域以可视化单个区域，或手动检查是否存在标记错误或未追踪的精子。如有必要，可右键单击单个精子以重新标记其运动状态。在本研究中，采用计算机辅助精子分析来记录各种速度和运动参数。

计算值包括直线性指数、线性指数和摆动性。激活溶液的渗透压影响了来自受试者解剖样本的精子运动能力。精子在水族馆用水中不活动，但在高渗和低渗的HBSS溶液中具有活动能力。

然而，与较高渗透压的溶液相比，在36毫渗透压/千克时，精子活力显著降低。精子采集方法也影响了精子活力，其中通过睾丸解剖法获得的精子活力显著高于腹部按摩法。此外，前向运动的细胞比例更高，且中速或快速运动的细胞数量更多。

与27摄氏度储存相比，在4摄氏度或冰上储存的精子其活力百分比和前向运动能力显著更高。环境和饲养条件也对精子活力有轻微影响。产卵前和产卵后采集的精子在活力方面未见显著差异。

将雄性个体单独饲养一个月后，其精子表现出较高的活力，但差异无统计学意义。通过腹部按摩法采集精子时，需要经过训练以掌握合适的镊子压力和操作动作，并避免粪便污染。该技术在生态毒理学研究中将非常有用，例如可用于评估多种污染物对雄性生育力的影响，其中青鳉是常用模式生物。