利用软件与冷却装置进行鱼类精子评估

本实验的主要目的是通过分析精子的运动能力来评估鱼类精子质量，从而促进人工授精的成功。我是瓦伦西亚大学教授、PROiSER R+D 公司科学总监 Dr. Carles Soler。我是来自 Impress 项目的研究员 Carina Caldeira。

CASA 技术是在几十年前为利用计算机辅助精液分析技术对哺乳动物物种进行精液分析而开发的。对于鱼类而言，需要注意两点。第一，这些动物通常在低温下受精，温度约为 4 °C，因此无法在室温下分析精液，而需要开发特定的工具来冷藏样品。

另一个问题是，精子在激活后活力会迅速下降，因此需要分析这一现象，以确定分析精液质量的最佳时机。接下来，我们将展示鱼类精子的分析方法，该方案是在哺乳动物方案基础上改进而来的，其中包括利用计算机辅助系统进行的活力分析。那么，让我们开始吧。首先对鱼类进行麻醉，然后注射激素，24小时后采集精子样本。

清洁生殖区域以避免污染。通过施加轻柔压力收集精子。精子样本保存在4°C，直至进行活力分析。

预先准备好稀释液和激活剂。将冷却块设置在4摄氏度，以保持样品温度恒定。等待其温度稳定。

使用针对每个物种特异的稀释液稀释精子样品。对于欧洲鳗鱼，精子用P1培养基以1:50的比例进行稀释。配制500微升稀释后的精子悬液，加入450微升P1培养基和50微升新鲜精子样品。

充分混匀。取一份活化剂溶液，置于冷却块中。将冷却台温度设置为4°C。

等待其稳定。选择运动性模块，如有必要，输入用户名和密码。选择属性。

点击物种，选择鱼类。选择每秒帧数以及您希望使用的图像数量。必须使用负对比度。

选择相应的计数室和刻度。针对每个物种，调整颗粒面积和连通性参数。对于欧洲鳗鱼，最小颗粒面积应为2，连通性应为7。

保存配置。打开捕获界面。取4 µL激活剂溶液，放入样品室中。

充分混匀稀释后的精子。取5 µL精子与激活剂混合，盖上盖玻片。

调整样本焦距，找到最佳观察区域。选择“录制视频”以获取根据速度分离的精子运动轨迹。可采集更多视野。

选择捕获区域并按之前步骤操作。点击退出以获得所有视野的总体图像。在激活后的特定时间间隔进行精子捕获。

然而，每个时间间隔的重复样本均进行了精子分析。通过选择相应字段并点击“部分”按钮，可获取每个时间间隔的部分报告。Excel 表格提供了部分数据的平均值、图表以及精子运动轨迹的图像。

对其他视野重复相同的步骤。另一种选择是总体数据。这些数据提供所有视野中各个精子的运动学参数值。

通过部分报告，可以立即使用饼图对不同时间的精子活动率和前向运动率百分比进行比较。总体数据提供了利用动力学参数进行多种统计分析的选项。精子运动轨迹提供三个参数。

VCL（曲线速度）、VSL（直线速度）、VAP（平均路径速度）。VCL 是最重要的参数，其数值随每秒帧数的变化而变化。增加每秒帧数，VCL 也随之增加，从而实现近乎完美的轨迹分析。

最佳帧率可能因物种而异。其目标是找到VCL的最高值，以便观察与其他工具（如计数板）之间可能存在的差异。亚群分析目前是一种重要的统计分析方法，可提供有关精子样本的更多信息。

这是大西洋鲑鱼精子样本的示例。在人工养殖条件下产生的不同世代中，可以观察到不同的精子亚群。我们展示了如何使用计算机系统进行鱼类精子分析，以及如何优化计数室、温度和帧率等技术和方法学方面的参数。

因此，利用这些数据，我们可以在多个领域开展大量分析工作，例如鱼类繁育，不仅可用于水产养殖，还可用于保护项目、系统发育研究，或加深对精子群体的认识。希望本实验方案能对您的研究有所帮助。