利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

制备转基因小鼠并分析其表型，能够帮助我们在活体条件下深入理解特定基因的功能。利用基因修饰动物模型，已揭示出众多重要的科学发现。本文所述方法能够以可接受的效率将长片段DNA导入干细胞，且无需药物筛选。

该技术不仅对基础生命科学具有重要意义，其研究成果还将应用于医学和动物科学等应用科学领域。本次实验操作将由本实验室的助理教授Emori Chihiro博士和副教授Ozawa Manabu博士进行示范。在制备小鼠胚胎成纤维细胞后，按照论文所述方法制备明胶包被的细胞培养皿，并在湿润培养箱中孵育两小时。

移除明胶溶液，用 PBS 洗涤培养皿两次，并在室温下保存备用。将有丝分裂失活的冷冻 MEF 储备液置于 37 摄氏度水浴中解冻一分钟。在 ESC 接种前一天，将 MEF 接种于经明胶包被的 60 毫米培养皿中。

如前所述，解冻一支冻存的胚胎干细胞（ESC）冻存管，将1×10⁵个ESC接种至一个含有预铺底层小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的60毫米培养皿中。然后加入4毫升ESC培养基，将培养皿置于培养箱中孵育，直至ESC达到50%至70%融合度。用4毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养的ESC后，在37°C条件下用800微升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化5分钟。

用一毫升 ESCM 灭活胰蛋白酶后，向细胞中加入一毫升新鲜 ESCM，将培养基转移至离心管中，并在 280 ×g 条件下离心五分钟以沉淀细胞。将细胞重悬于一毫升新鲜 ESCM 中，使用台盼蓝染色法通过细胞计数仪测定细胞浓度。将 1×10⁵ 个胚胎干细胞转移至新的 1.5 毫升离心管中，用 PBS 洗涤三次（每次均通过离心），然后将细胞沉淀重悬于 12 微升 Cas9 RNP DNA 混合液中，轻轻吹打混匀，避免产生气泡。

然后，将悬浮的胚胎干细胞用于电穿孔。接着，将电穿孔后的胚胎干细胞培养于60毫米培养皿中，内含4毫升胚胎干细胞培养基（ECSM），并加入有丝分裂失活的MEF细胞，每天更换培养基。电穿孔后3至5天，用4毫升PBS洗涤胚胎干细胞，随后加入800微升0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化，并在湿润培养箱中继续培养。

随后，加入 2 mL ESCM 以终止胰蛋白酶消化。待细胞混合物离心沉淀后，将沉淀物重悬于 1 mL 新鲜 ESCM 中，并使用台盼蓝染色法通过细胞计数仪测定细胞浓度。将 ESCs 以每 60 mm 培养皿 1 × 10³ 个细胞的密度接种，培养皿中需含有 ESCM 和饲养层 MEF。

确保更换培养基直至克隆被挑取。首次传代后5至7天，当从ESC培养皿中吸出ESCM后，加入4毫升PBS。在体视显微镜下，使用20微升移液器，用5微升PBS挑取单个ESC克隆。

将单个菌落放入含有15微升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液的圆底96孔板的孔中。孵育96孔板后，加入80微升ESCM以终止胰蛋白酶消化，并通过吹打将ES菌落解离为单细胞。进行PCR基因分型时，将40微升ES细胞悬液转移至每孔含有50微升ESCM的明胶包被、无饲养层的96孔板中。

为制备冻存的 ESC 菌株，将剩余的 60 微升 ESC 悬液转移至含有 500 微升 ESCM 和饲养层 MEF 的明胶包被 24 孔板的一个孔中。在 24 孔板中培养单个 ESC 克隆，直至其达到 60% 至 80% 汇合度，然后通过胰酶消化回收单个 ESC 克隆，操作方法如前所述。离心获得细胞沉淀后，将其重悬于 500 微升细胞冻存液中，于 -80 摄氏度冻存细胞。

进行PCR基因分型时，按照之前所述方法培养ESC克隆，用移液枪吸去每孔中的ESCM，并用100微升PBS洗涤两次。吸去PBS后，加入100微升含有蛋白酶K的裂解缓冲液，充分混匀。随后将ESC裂解液转移至新的1.5毫升离心管中，置于65摄氏度的加热箱中至少孵育1小时。

将基因组DNA溶解于20微升无DNase的水中后，使用分光光度计测定DNA的纯度和浓度。使用位点特异性引物组进行基因组PCR以扩增目标区域后，检测序列并筛选出具有理想敲入序列的ESC克隆。将激素处理的雌鼠与ICR雄鼠交配并收集输卵管后，将所获输卵管置于FHM液滴中，并用冲洗针插入漏斗部，以FHM冲洗输卵管以回收处于二细胞或四细胞阶段的胚胎。

使用口吸管将收集的胚胎转移至数滴新鲜的FHM液滴中进行清洗。将胚胎置于覆盖矿物油的35毫米细胞培养皿中的50 µL KSOM液滴内进行培养，培养方法同前文所述，持续培养一天，直至发育至八细胞期或桑葚胚阶段。使用拉针仪和显微操作仪制备用于固定胚胎和ESC注射的玻璃移液管。

将含有FHM的持卵管连接至与显微注射仪相连的毛细管架后，将其安装在显微操作仪的左侧。将注射针连接至另一台显微注射仪，并安装在右侧。调整两根针的位置，使其在显微镜视野中呈直线对齐。

在60毫米培养皿的同一皿盖上，并排滴加5微升12%聚乙烯吡咯烷酮溶液和5微升FHM溶液。用矿物油覆盖液滴。将胚胎转移至5微升FHM液滴中，并向含有胚胎的FHM液滴中加入1至5微升ESC悬浮液。

用聚乙烯吡咯烷酮冲洗注射针后，将注射针移至含有胚胎和ESCs的液滴中。在注射针中挑选三个刚刚完成细胞分裂的ESCs双细胞团。用固定针通过抽吸固定一个已完成压缩的八细胞期或桑葚胚期胚胎，并利用压电脉冲在透明带打孔。

将六细胞期的胚胎干细胞（ESC）从透明带内推出，并将移液管从胚胎中抽出。用口控移液器将注射了ESC的胚胎轻轻经过数滴KSOM液滴进行洗涤，然后将其转移至一个新的、覆盖石蜡油的50微升KSOM液滴中培养，直至胚胎发育至囊胚阶段，操作方法如前所述。经PCR扩增后获得了与敲入靶点大小相符的特异性条带，22个克隆中有9个显示出敲入特异性的PCR条带。

这些结果在无任何药物筛选的情况下均能高效且可重复地实现基因敲入。选择大小合适的胚胎干细胞集落对本实验步骤至关重要。应避免挑选过大或过小的集落。

利用受精卵进行CRISPR Cas9介导的直接基因组编辑适用于制备简单的基因敲除小鼠。该CRISPR Cas9介导的ESC基因靶向技术方案有助于生产多种转基因小鼠，用于生命科学领域的后续分析。