微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

该方法可使我们构建具有可控纤维取向程度的三维胶原蛋白水凝胶，以模拟体内健康和病变组织中的微环境。该技术提供了一种简便的微流控方法，用于制备取向性胶原水凝胶、引入细胞，并量化细胞在拓扑结构明确的三维环境中的行为。本实验操作将由Neil Joshi、Mehran Mansouri、Ann Byerly和Justin Vidas为我的实验室进行演示。

首先，将厚度为250微米的PDMS片固定在塑料载片上，使用刻刀以0.5毫米的刀深、1厘米/秒的速度和高力度在刻图机上切割出微流控设计。将切割好的微流控通道置于超声波清洗仪中清洗5分钟。用去离子水冲洗经超声处理的通道，并在100摄氏度的加热板上干燥5分钟。

将通道存放于洁净、加盖的培养皿中，直至使用。为制备PDMS覆盖层并实现表面功能化以供后续修饰，取1毫升氨基丙基三乙氧基硅烷加入49毫升丙酮中，于玻璃烧杯内配制2%氨基丙基三乙氧基硅烷溶液。接着，将25%戊二醛溶液用去离子水稀释至5%。

每个 24 毫米 × 50 毫米 的盖玻片配制两毫升溶液。使用异丙醇（IPA）在超声波清洗机中清洗盖玻片，超声 5 分钟。用去离子水冲洗盖玻片上的异丙醇。

盖玻片上形成一层均匀的水膜表明异丙醇已彻底冲洗干净。将盖玻片置于100°C的加热板上干燥5分钟。将干燥后的盖玻片放入洁净的培养皿中，确保彼此不重叠。

使用电晕放电笔，将盖玻片逐一暴露于电晕放电中持续一分钟。在电晕处理后的五分钟内取出盖玻片，并将其浸入氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中10秒，确保盖玻片完全浸没。随后，将盖玻片从氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中取出，浸入丙酮中10秒，并用压缩空气吹干。将干燥的盖玻片放回培养皿中，处理面朝上。

用移液器将一毫升戊二醛溶液滴加到每张盖玻片表面。尽可能覆盖大面积，但避免溶液溢出盖玻片边缘。让盖玻片与溶液接触静置30分钟，然后用去离子水冲洗20秒。

使用压缩空气干燥盖玻片，并将其放回培养皿中，等离子处理面朝上。对于模块化磁性底座的激光切割，使用适当的激光参数（如扫描次数和功率）从PMMA层切割出设计图案。应调整激光参数，以便磁铁能够压入PMMA层中。使用肥皂和水清洗激光切割后的部件，以去除激光加工过程中产生的碎屑。

请勿使用溶剂，因为它们可能会导致激光切割边缘的微裂纹扩展。组装平台时，用手将磁铁推入激光切割的底座中。磁铁的厚度必须小于PMMA底座的厚度，以确保磁铁与底座表面齐平。

剥离压敏胶（PSA）片的背衬，将基底的功能化面朝上贴附于经戊二醛处理的盖玻片上。将PDMS通道切片轻轻放入由框架界定的空腔中。用宽头镊子轻压，以去除气泡并确保紧密贴合。

将经牛血清白蛋白（BSA）处理的通道盖置于通道切口上方，确保BSA处理面朝下。使流体入口和出口与通道对齐。该装置现已准备好进行I型胶原蛋白注射。

将一个注射泵、一个预冷的无菌注射器、预冷的中和I型胶原溶液以及一个无菌的20号规格、90度角尖端、鲁尔锁式针头放入生物安全柜中。将I型胶原溶液装入注射器，避免产生气泡。将针头连接至注射器，将注射器装入注射泵，使针头朝下，并用I型胶原溶液预冲洗针头。

将注射泵设置为所需的流速，介于每分钟 50 至 2,000 微升之间。将制备好的 PDMS 通道置于实验升降台上，并与针头对齐。将针头插入 PDMS 通道的进样口。

注入通道，直至出口端形成一个30微升的I型胶原液滴。降低实验台升降架，轻轻将针头与已填充的通道分离。重复此操作，直至所有通道均被I型胶原溶液填充。

将填充好的通道连同浸透去离子水的洁净无绒擦拭布一起放入培养皿中，以防止新形成的Ⅰ型胶原凝胶脱水。盖上培养皿，将装有通道的培养皿放入培养箱中孵育2小时，然后进行剥离操作。进行剥离和培养基平衡时，先用镊子小心取下PDMS盖片，暴露出已聚合的Ⅰ型胶原凝胶。

向孔中加入 650 微升内皮细胞生长培养基。或者，可连接另一个模块以引入额外的胶原层或提供培养基灌注功能。将装置置于培养箱中至少四小时，以使凝胶和培养基达到平衡。

在接种细胞前更换培养基。对玻璃盖玻片进行功能化处理可实现通道剥离，而对PDMS盖片进行BSA功能化处理则可防止I型胶原的附着。剥离盖片后，I型胶原纤维的排列保持不变。

在基质的定向排列区域培养的HUVECs图像显示，与随机纤维区域上的HUVECs相比，其肌动蛋白纤维的排列程度显著增加。我们的方法可用来模拟肿瘤微环境，并量化不同类型细胞的响应情况。此外，我们还可引入流动通道以支持长期实验。