用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

本实验的总体目标是构建用于血管组织再生的管状结构。首先采用模具技术，将Ⅰ型胶原与平滑肌细胞结合形成圆柱形结构；第二步是在专门设计的静态生物反应器中对构建物进行成熟培养。

接下来，小心收获成熟的构建物，并使用旋转壁式生物反应器在构建物的管腔内接种内皮细胞。最终，通过组织学分析、代谢检测和力学测试来评估这些管状构建物的特性。该技术的创新之处在于，仅需一步即可将细胞与胶原结合，生成具有目标力学性能的组织工程构建物，无需任何额外的物理或化学处理。

此外，由于采用了专门设计的握持结构，该构建体可轻松进行操作，并实现末端连接。该方法可揭示细胞与细胞外基质在血管组织再生过程中的生长与重塑相互作用。同时，该方法还可应用于多种靶向组织，如肌腱、皮肤移植物、心肌补片以及神经系统。

首先，按照随附文本方案中所述的方法，制备并组装静态生物反应器，其中包括储液池和纱布、夹具的制作、心轴帽、外壳模具的组装以及灭菌技术的详细说明。接下来，在175平方厘米的组织培养瓶中扩增猪主动脉平滑肌细胞，直至细胞融合度达到90%。采用标准培养技术收获细胞，然后将细胞以每毫升400万个细胞的密度重悬于完全培养基中。

接下来，将一份缓冲液、两份每升含四克无菌胶原蛋白溶液和一份细胞悬液混合。按此顺序，测量混合物的pH值，并确保其在pH 7.0至7.4之间。然后将细胞-胶原混合物缓慢倒入已组装好的模具复合体中。

确保混合物中无气泡。将胶原凝胶在无菌环境中于室温下静置一小时。一小时后，移除外层套管，小心地将构建物转移至含有35毫升预热培养基的储液器中。

将构建物置于垂直位置，静置培养一至两周。每两天更换一次培养基，通过从下部隔膜端口吸出旧培养基，并向储液器中补充等量的新鲜培养基。如需进行生化分析，可在每次换液时分别收集1毫升新旧培养基，在最初12小时内每小时取样一次，之后每24小时取样一次。

在无菌条件下将构建物从培养基中取出，并将其垂直放置于扫描激光干涉仪的光路中，以测量静态成熟一周至两周后的构建物厚度。将生物反应器转移至细胞培养操作台，轻轻将构建物从芯轴上取下。待其完全脱离后，将其放入直径为100毫米、含有40毫升新鲜培养基的培养皿中。

接下来，设置一台配备5至10牛顿载荷传感器的微机械测试仪，并连接夹具，使其延伸至保持在37摄氏度的PBS溶液浴中。将构建物从培养皿中取出，并连接至专用夹持装置，用于进行纵向测试，该装置设计为与构建物的纱布部分连接，同时避免压碎凝胶。使用聚四氟乙烯胶带防止测试过程中夹持装置发生滑动。

然后将构建物安装到微型力学测试仪上。接下来，在纵向上进行疲劳测试，首先将构建物拉伸至其初始标距长度，并保持10分钟。随后以每秒5%的速率施加30次10%的循环应变。

以10%的循环应变逐步增加应变，直至样品在周向方向上发生失效。首先将试样切割成10毫米长的环状结构，然后将这些环状结构安装到不锈钢棒上，以替代夹具使用。

与纵向测试相同，首先将构建物拉伸至其初始标距长度，并在此长度下保持10分钟。接着，以每秒5%的速率施加30次10%的循环应变。待构建物成熟并从芯模上取下后，将其两端固定于储液槽，并放入储液槽组件中。

如图所示。在储液槽外部加入 30 毫升培养基。接下来，用蛋白质混合物填充支架管腔体积的 75%，然后封闭支架的两端。

为避免蛋白质溶液泄漏，将生物反应器置于培养箱内，并以4.02 × 10⁻⁵ GForce转速旋转1小时，使管腔表面被蛋白质包被。当采用标准技术培养的人脐静脉内皮细胞和尿路上皮细胞达到90%融合时，收集细胞，重悬于补充了M199培养基的培养液中。随后，将人脐静脉内皮细胞和尿路上皮细胞接种至支架的管腔内。

以每平方厘米1000个细胞的密度接种，封闭支架的上端以避免细胞悬液泄漏。将支架置于旋转壁式生物反应器中，在恒定转速下以4.02 × 10⁻⁵G的离心力培养两天。在血管支架静态成熟过程中，细胞上升结构的外径迅速减小。

如图所示，在静态培养的第一天，构建物的直径缩小至初始值的60%。到第七天时，构建物直径已缩小近85%。构建物在纵向和周向的应变循环均表现出典型的基于胶原的构建物所具有的黏弹性特性。总体而言，在相同的应变范围内，构建物在纵向方向上的强度高于周向方向。对内皮构建物进行的Masson三色染色显示，内皮层高度均一。

平滑肌细胞呈梭形形态，并均匀分散于管壁中，而内皮细胞则在管腔侧充分伸展。在此技术发展之后，为生物力学和再生医学领域的研究人员探索工程化组织与天然组织的力学行为开辟了道路。

观看本视频后，您应该已经充分了解如何快速构建血管样结构，并最终使其强度足以进行人工操作，以及用于动态生物反应器中的力学刺激。我们希望，我们的努力和成果已使您认识到细胞与细胞外基质模型在构建具有生物学功能的组织方面所具备的巨大潜力。