模拟人类小脑发育 体外 在二维结构中

该方法有助于研究早期人类小脑发育过程，以及其在神经精神疾病中可能发生的改变。该方法的主要优势在于，无需执行复杂的操作步骤，即可在二维层状结构中生成发育早期的人类小脑细胞，且具有成本效益。

制作拉制毛细管在初期可能较为困难，但通过练习和时间积累，会逐渐掌握更易操作的拉制方法。实验准备开始时，在巴斯德移液管颈部下方约两厘米处进行加热，使用本生灯将一根长22.9厘米的巴斯德移液管拉制成两根玻璃移液管。较细的一端比另一端约短四厘米。

将拉制好的移液管尖端在火焰上弯曲，形成平滑的R形，然后将拉制的移液管放入高压灭菌袋中，并在高压灭菌器中进行灭菌。在第0天，向每个六孔超低吸附（ULA）板的孔中加入1毫升小脑分化培养基，培养基中添加10 µM Y-27632和SB-431542，并将培养板放入培养箱中，直至悬浮的细胞集落准备好加入各孔中。使用拉制的玻璃移液管清洗已分化的细胞。

吸去培养基，每个35毫米培养皿中加入1毫升iPSC传代溶液。在37摄氏度孵育3分钟后，吸去培养基，加入2毫升小脑分化培养基，培养基中添加10微摩尔Y-27632和SB-431542。在倒置透射光显微镜4倍放大下，用拉制玻璃移液管的弯曲边缘挑起细胞集落。待所有集落均被挑起后，用10毫升血清移液管轻柔地将全部集落转移至一个六孔ULA培养板的孔中。

对每一块iPSC培养板重复此操作，并将细胞置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育。在第2天，向每个孔中加入FGF2，使其终浓度为50纳克/毫升。在第7天，通过吸取1毫升用过的培养基并替换为1毫升新鲜的小脑分化培养基，更换三分之一的培养基。

将拟胚体孵育七天。第14天时，轻轻旋转培养板，使所有拟胚体聚集于培养板中央。然后倾斜培养板，用1000微升移液器从边缘吸除全部用过的培养基。

随着培养基量的减少，缓慢将培养板放平并继续吸除培养基，保留足够的液体以避免将胚状体吸出。接着，加入3毫升新鲜的小脑分化培养基，其中添加10微摩尔Y-27632。然后，使用10毫升血清移液管将胚状体转移至经多聚-L-鸟氨酸-层粘连蛋白包被的培养皿中。

第15天，吸除培养基，并更换为新鲜的小脑分化培养基。在第0天，将iPSC集落进行清理后转移至含有SB-431542和Y-27632的小脑分化培养基中，并置于超低吸附培养板中以生成拟胚体。第2天加入FGF2，并在第7天更换1/3培养基，结果在第14天观察到拟胚体体积增大。

从第15天开始，细胞从类胚体向外迁移到包被的表面。从第21天起将培养基完全更换为小脑成熟培养基，到第35天时形成了具有神经元样形态和复杂结构的单层细胞。第35天的基因表达分析显示，这些细胞表达早期小脑前体细胞标志物，如谷氨酸能前体细胞、ATOH1、GABA能前体细胞、PTF1α，以及浦肯野前体细胞标志物KIRREL2和SKOR2。

此外，还观察到菱形唇标志物 OTX2 和主要位于前部的神经元特异性标志物 SIX3 的表达。第35天收获的细胞进行免疫荧光标记，结果显示小脑标志物 EN2 和 PTF1α、神经元标志物 β-tubulin III 以及增殖标志物 KI67 均呈阳性染色。使用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色，显示了细胞核。

要成功实现分化，关键在于使用健康且未分化的iPSC集落作为起始材料，并尽可能使用 freshly reconstituted 的试剂。