在人类造血干细胞和祖细胞中构建致癌性杂合功能获得突变

该方法可对原代人造血干细胞和祖细胞中的复发性白血病驱动功能获得性突变进行精确建模，从而研究其在白血病转化中的作用。该技术的主要优势在于，基于CRISPR-Cas9的突变构建与荧光报告基因的引入相结合，从而能够唯一地识别、富集并追踪纯合的杂合突变细胞群体。

本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Tommaso Sconocchia 演示。首先，使用在线 Benchling 设计工具设计单导向 RNA：选择“plus create”选项，然后点击“DNA sequence”，接着选择“import DNA sequences”和“import from databases”选项。

然后输入目标基因，并选择“human”作为物种。点击“search”选项，选择正确的转录本导入。选择要引入双链断裂的感兴趣区域。

然后在屏幕右侧选择 CRISPR 选项，接着选择设计和分析向导。接下来选择单向导 RNA，并将向导序列长度保持为 20 个碱基对，PAM 序列为 SP-Cas9 编辑所用序列。选择一个靶上得分高且脱靶得分高的向导，从商业供应商处订购经过化学修饰的合成单向导 RNA。

设计HDR模板时，将基因组序列和编码序列导入分子克隆软件。从基因组序列文件中，通过在双链断裂位点的5'端选择约400个碱基对来设计左侧同源臂，并将该序列粘贴至新文件中。从基因组序列文件中，通过选取目标内含子的最后150个碱基对作为剪接受体序列，并将其粘贴至左侧同源臂之后。

从编码序列文件中选择目标 cDNA。对 cDNA 进行密码子优化，并将其插入剪接受体序列之后。在目标 cDNA 的下游，于荧光蛋白的启动子序列之后插入一个 3' 端多聚腺苷酸化信号。

然后，插入荧光蛋白的序列以及第二个但不同的多聚腺苷酸化信号。从基因组序列文件中，通过在双链断裂的三端选择理想长度为400个碱基对的序列来设计右侧同源臂，并将该序列插入到第二个多聚腺苷酸化信号之后。接着，创建整个模板的一个拷贝，并修饰目标cDNA，使其包含所需突变的序列。

将荧光蛋白替换为另一种荧光蛋白。将HDR模板构建并克隆至AAV表达载体中。为制备重组AAV6，准备10个直径150毫米的培养皿，每个培养皿中含有1100万个HEK293T细胞，培养基为20毫升DMEM，添加10% FBS、1%青霉素-链霉素和25毫摩尔HEPES。

然后，将培养皿放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养24小时。小心弃去旧培养基后，加入20毫升不含抗生素的DMEM培养基，该培养基需添加10% FBS、25毫摩尔HEPES和1毫摩尔丁酸钠。接着，准备两个15毫升离心管，分别标记为管一和管二。

向第一管中加入 5 毫升低血清培养基、60 微克重组 AAV6 突变 HDR 质粒和 220 微克 PDGM6 辅助质粒。向第二管中加入 5 毫升低血清培养基和 1120 微升浓度为 1 毫克/毫升的聚乙烯亚胺溶液。将第二管中的内容物加入第一管后，涡旋振荡 30 秒，然后在室温下孵育 15 分钟。

将1.1毫升溶液逐滴小心加入每皿中，并通过轻柔旋转混匀。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育48小时。然后向每皿中加入250微升0.5摩尔EDTA，并将培养皿放入培养箱中孵育10分钟。

通过将细胞从培养皿上冲洗下来收集细胞，并转移至500毫升离心管中。在4摄氏度下以2000 ×g离心10分钟，弃去上清液。通过涡旋振荡使沉淀松散，然后使用AAV纯化试剂盒提取病毒。

将纯化的病毒分装后，于-80摄氏度保存。解冻CD34阳性造血干细胞和祖细胞后，将细胞转移至10毫升预热的含1%青霉素-链霉素的RPMI培养基中。在室温下以350 × g离心10分钟。

将细胞悬浮于造血干细胞和祖细胞保留培养基中，调整细胞浓度至每毫升250,000个细胞，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育72小时。随后，将细胞收集至15毫升离心管中，通过台盼蓝排斥法进行细胞计数并检测细胞活力。

为制备核糖核蛋白复合物，取15微克Cas9和8微克单链向导RNA加入1.5毫升离心管中，在加热块中25摄氏度孵育10分钟。在核糖核蛋白复合物孵育的同时，将细胞在350 ×g离心5分钟，并弃去上清液。用100微升核转染溶液重悬细胞后，将细胞与核糖核蛋白复合物混合，并转移至电转杯中。

轻轻敲击比色皿以去除任何残留的气泡，然后将比色皿插入转染系统的电穿孔仪样品槽中，对细胞进行电穿孔。电穿孔后立即加入400 µL预热的不含青霉素-链霉素的造血干细胞与祖细胞维持培养基，并用细口移液器将细胞转移至含有预热的不含青霉素-链霉素的造血干细胞与祖细胞维持培养基的培养板中。随后将培养板放入培养箱中。

将含有冷冻重组AAV的冻存管置于冰上解冻，并通过移液器将每种重组AAV6的最佳用量加入细胞悬液中进行转导。用移液器轻轻混匀细胞悬液后，将转导后的细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育6至8小时。孵育6至8小时后，将细胞收集至离心管中，在室温下以350 G离心5分钟。

弃去上清液，加入新鲜的预热造血干细胞和祖细胞维持培养基（含青霉素-链霉素），并将细胞转移至细胞培养板中。于37°C及5%二氧化碳条件下培养48小时。为了分选携带杂合功能获得性突变的工程化细胞，将细胞收集至15毫升离心管中，于室温下以350 ×g离心5分钟，操作如前所述。

弃去上清液，将细胞重悬于 1 毫升含 0.1% PSA 的 DPBS 中，于室温下以 350 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液后，根据细胞数量，将细胞重悬于适量体积的含 0.1% BSA 的 DPBS 中，操作方法如前所述。将细胞转移至配有盖子的无菌 FACS 管中，并向细胞悬液中加入 7 µL AAD 或其他活/死细胞染料，用于排除死细胞。

将表达两种荧光报告蛋白的活细胞分选至含有200微升造血干细胞与祖细胞保存培养基的收集管中。参照之前的方法，将分选后的细胞在室温下以350 ×g离心5分钟，重悬至浓度为250,000个细胞/毫升，用于后续培养扩增或直接用于功能检测。在使用核糖核蛋白复合物进行转染并用重组AAV6病毒转导后的第2天，通过流式细胞术对细胞进行分析。

检测到四个主要细胞群体，包括未发生基于HDR的基因组编辑、且不表达GFP或BFP的细胞；仅表达GFP、且仅整合了野生型构建体的细胞；仅表达BFP、且仅整合了突变型构建体的细胞；以及同时表达GFP和BFP的双阳性细胞，后者整合了野生型和突变型序列。为验证杂合型钙网蛋白突变的成功敲入，对仅与AAV共孵育的细胞以及与核糖核蛋白复合物和携带敲入序列的AAV共孵育的细胞中提取的基因组DNA进行了“敲入/敲出”PCR分析。在DNA提取前，根据两种荧光报告基因的同时表达对细胞进行了分选。

凝胶电泳后，从凝胶中切下目标条带，并提取DNA用于后续的Sanger测序。测序结果证实了野生型和突变序列在杂合型钙网蛋白突变造血干细胞和祖细胞中成功实现了无缝整合。进行该实验时最重要的是要仔细筛选表现最佳的单导向RNA，因为这将决定整体的HDR效率，从而影响杂合突变成功敲入的频率。

通过该程序，经基因工程改造的细胞可用于功能性体外和体内实验，例如集落形成单位检测、分化检测以及移植到免疫缺陷小鼠体内。