基于微泡浮选法从人外周血单个核细胞样本中分离、活化和扩增T细胞

微气泡激活与扩增方案具有重要意义，因为它解决了细胞治疗研究与生产领域中长期存在的重大未满足需求，可提高T细胞疗法的持久性与疗效。Akadeum基于浮力的阳性筛选、激活及扩增技术，能够在激活与扩增工作流程中限制过度刺激，从而减少T细胞耗竭。首先，将3×10⁸个 commercially obtained PBMCs 与生物素标记的抗CD3抗体在2.5 mL分离缓冲液中孵育。

用移液器轻轻混匀各组分，在室温下孵育10分钟。根据生产商说明书，按0.5至1的比例将去除非特异性结合的亲和素微泡加入细胞中，并在室温下使用商用滚轴混合仪以20 RPM转速混合10至15分钟。

在室温下以 400g 离心五分钟。离心后，经阳性筛选的细胞将与去除了亲和素的微泡一起位于悬浮液的上层，而未被筛选的剩余细胞则位于管底的细胞沉淀中。使用一支九英寸玻璃移液管，将管尖插入气泡细胞层下方直至管底。

使用电子移液器吸弃细胞沉淀和上清液，并将其转移至新管中。将原始管中残留的气泡细胞层用1 mL完全T细胞培养基重悬。将上清液在室温下以400×g离心5分钟，用于纯度和回收率的间接测定。

将上清液和未选择的细胞离心后，吸除上清液，并将沉淀物重悬于1毫升培养基中，然后进行计数。使用自动细胞计数器，通过明场显微镜对上清液中的细胞进行计数，并根据文本稿件中的描述确定被捕获在微泡细胞层中的细胞数量。为制备偶联了抗CD28的去 avidin 微泡，将生物素化的抗CD28抗体加入商用微泡中，并通过翻转混匀仪混合至少两小时。

将偶联了链霉亲和素的抗CD28微泡以1.5:1的比例加入已制备的细胞悬液中。使用翻转混匀法混合15分钟。然后根据所获得的细胞数量，用完全T细胞培养基或其他所需培养基将总体积调整至每毫升含200万细胞。

将1毫升活化细胞接种于24孔板中，在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。24小时后，根据第0天接种的初始细胞数量计算，加入IL-2和可溶性抗CD3抗体以促进细胞进一步扩增。将细胞板重新放回湿润的二氧化碳培养箱中，于37°C过夜孵育。

每两天从培养上清中移除一半的培养基，更换为新鲜的完全T细胞培养基，并添加白细胞介素-2（IL-2），使其终浓度为50单位/毫升。每周检测两次T细胞数量，以评估细胞密度。

当细胞密度超过每毫升2 × 10⁶或2.5 × 10⁶个细胞时，将其转移至更大的容器中，并稀释至每毫升5 × 10⁵个细胞。通过上下吹打轻轻混匀每个孔中的内容物。移除孔内的全部内容物，包括微小气泡，并将其转移至1.5 mL离心管中。

用 400 µL 无钙无镁的 DPBS 洗涤每个孔，并将溶液转移至 1.5 mL 离心管中。然后在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 50 µL 分离缓冲液中。

接下来，将50微升细胞悬液均分为两份，每份25微升，分别用于活化和耗竭检测。使用活化与耗竭抗体染色混合液对细胞进行染色，并在室温避光孵育10分钟。加入1毫升分离缓冲液，轻轻混匀后离心，以去除多余的抗体。

吸弃上清液。将细胞沉淀重悬于1毫升分离缓冲液中，并转移至适合流式细胞术分析的容器中。与对照样品相比，接受微泡共刺激的细胞中活T细胞数量和转基因阳性T细胞数量均有所增加。

在微泡样本中也观察到效应细胞群体增加。存活的活化T细胞表达升高的早期活化标志物CD69以及中晚期活化标志物CD25。接受微泡共刺激的细胞样本中，耗竭标志物PD1阳性细胞的总数和百分比也显著升高。

正确混合和分注微泡至关重要，以确保准确的剂量，因为微泡在无搅拌条件下会迅速上浮至表面。我们完全预期该方法能够实现大量T细胞的快速生长，且其活性高于其他方法中常见的耗竭程度较高的T细胞。