单细胞表达分析 Pseudomonas syringae 植物组织中的基因

本实验方案提供了一种温和的植物接种与提取方法，可回收在叶片质外体中生长的细菌群体，适用于流式细胞术等单细胞基因表达分析。该方法能够从质外体中提取出大量细菌，同时显著减少植物细胞碎片对样品的污染。这一优化的质外体细菌回收方法可直接应用于多种植物-细菌体系，或仅需少量修改即可适用，包括植物致病菌和有益的内生细菌体系。

演示该实验步骤的是我们实验室的博士生 Nieves Lopez-Pagan。首先，取一个直径为10厘米的花盆，装入事先已加水的蛭石与基质按1:3比例混合的栽培基质。用带孔的金属网覆盖花盆，并用橡皮筋将金属网固定在湿润的土壤表面。

接下来，用湿润的牙签将拟南芥种子播入金属网孔的孔洞中。每个花盆内选择相距较远的位置放置三到四粒种子。用塑料罩盖住花盆以保持较高的相对湿度，并在4°C条件下孵育72小时进行春化处理。

将花盆转移至短日照条件下的植物生长室中。揭开花盆时，取下塑料罩。种子萌发后，用镊子移除大部分幼苗，每个花盆位置保留一株幼苗。

然后通过在培养皿底部铺上一张湿润的纸巾，并将菜豆种子放在其上来准备菜豆（Phaseolus vulgaris）植株。用医用胶带密封培养皿，在28°C条件下培养3至4天。将已萌发的种子转移至直径10厘米、装有湿润蛭石与基质按1:3比例混合的培养盆中，并在植物生长室的长日照条件下进行培养。

从-80摄氏度的甘油保存菌种中挑取目标丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）菌株，在含有适当抗生素的LB平板上划线。于28摄氏度培养40至48小时。刮取细菌生物量，并将其重悬于5毫升10毫摩尔的氯化镁溶液中。

在600纳米处测定光密度，并通过添加10毫摩尔氯化镁将其调整至0.1。在10毫摩尔氯化镁中进行系列稀释，以获得每毫升5×10⁵ CFU的最终接种浓度。然后，为拟南芥植物制备200毫升接种液，为菜豆植物制备50毫升接种液。

接种前，将表面活性剂Silwet L-77分别加入至终浓度为0.02%用于菜豆接种，0.01%用于拟南芥接种。进行拟南芥浸润时，在花盆上方交叉放置两根木棍形成“X”形，然后将花盆倒扣于直径14厘米、含有200毫升接种液的培养皿上。对菜豆叶片进行接种时，将植株和接种液放入真空室中，并将叶片插入含有接种液的50毫升锥形离心管内。

用500毫巴的压力脉冲处理30秒，使叶片充分渗透。用一张纸吸去多余的接种液，然后将植株放回相应的生长室中。接种后第四天，切下拟南芥植株的地上部分或菜豆植株的接种叶片，并将其放入一支20毫升无针头的注射器中。

对于豆类叶片，将叶片自身卷起，使远轴面朝外。加入足够体积的蒸馏水以浸没组织。然后，将装有注射器的活塞插入并保持直立位置，轻轻敲击注射器筒体以排出内部多余的空气和气泡，直至所有空气聚集在尖端附近；排尽空气后，用石蜡膜封住注射器筒体的尖端。

现在小心推动柱塞以产生正压，直至组织颜色变深。然后，回拉柱塞以产生负压。移除石蜡膜和柱塞，并收集含有质外体提取细菌的液体。

进行单细胞分析时，用蒸馏水配制1.5%的琼脂糖溶液。待其融化后，加入足够体积的溶液，填充并排放置的两张显微镜载玻片之间的空隙，并在上方再放置一张载玻片。静置15分钟，然后小心移去上方的载玻片。

使用刀片将琼脂糖垫切割成 5 毫米 × 5 毫米的小块，备用。同时，将 1 毫升提取自质外体的细菌进行离心。用移液器小心吸除上清液，并将沉淀重悬于 20 微升水中，以浓缩细胞。

取2微升浓缩的细胞液滴加到厚度为0.17毫米的盖玻片上，然后用一块琼脂糖垫覆盖液滴。在共聚焦显微镜下观察细菌样品，使用特定激光识别绿色荧光细菌。通过明场成像识别所有细菌，并将明场与荧光图像合并。

为了通过流式细胞术进行分析，取一份从质外体提取的细菌悬液。使用流式细胞仪分析样本，并采集100,000个事件。hrpL GFP的表达通过GFP荧光进行监测。

点图显示了群体中GFP荧光强度分布与细胞大小的关系，而直方图则显示了GFP荧光强度与细胞数量的关系。hrpL ON的百分比高于相应的hrpL OFF百分比。荧光显微镜图像显示与hrpL表达相关的GFP水平具有异质性。

观察到荧光蛋白（GFP）荧光较弱或无荧光的细菌。为获得最佳结果，在细菌提取步骤中应轻柔操作，以避免损伤植物组织，从而减少植物细胞内容物的污染。所获得的细菌样品可用于其他有利于降低植物污染的应用，例如后续细菌基因组或转录组分析所需的核酸提取。