使用扩展显微镜技术对整体安装的 Drosophila 胚胎进行物理放大以实现超分辨率成像

该方案可在大多数食管发育生物学实验室中实施，使无法使用超分辨率显微镜的研究人员也能获得超分辨率图像。该技术的主要优势在于，通过直接扩增样本本身，使研究人员无需超分辨率显微镜即可突破传统共聚焦显微镜的衍射极限。本方案对于研究蛋白质定位如何影响完整胚胎中细胞形态或功能的研究者尤为有益，特别是当这些蛋白质形成复杂的亚细胞结构或网络时。

人们在操作过程中最常见的问题是胚胎在整个实验流程中脱落。建议多次涂布多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine），以牢固地黏附胚胎。放置胚胎后，取一个直径6厘米的塑料培养皿底部，其中一半填充3%琼脂。

用剃刀或解剖刀在琼脂上划出一个5厘米×3厘米的矩形。用小型实验室刮刀取下琼脂块。然后将培养皿的底部倒置，放在实验台上，并将琼脂块放置在倒置的培养皿底部上方。

打开培养皿盖子，确保其内部干燥。戴上手套后，将一片双面胶贴在皿盖内侧。从摇床中取出装有包被和固定胚胎的离心管，垂直放置在实验台上。

静置，使有机相和水相分层。固定良好的胚胎应停留在两相交界处。使用巴斯德吸管和P200移液器彻底移除下层水相。

使用带有乳胶吸头的玻璃巴斯德移液管，将固定的胚胎分多次小批量转移至琼脂板上，以防止胚胎粘附在移液管内壁。胚胎转移至琼脂板后，使用P200移液器去除胚胎周围残留的庚烷。随后，从两厘米高度将双面胶盖轻轻落下，使其接触琼脂板，从而使胚胎粘附于胶带上。

轻轻取下琼脂板的盖子，将其倒置放在实验台上，并加入足量的含吐温磷酸盐缓冲液（PBS Tween），以浸没盖子中的胚胎。使用体视显微镜在100倍放大倍数下配合间接照明，收集所需胚胎。用细玻璃针在胚胎前端或后端附近的卵黄膜上刺破一个小孔，以使膜塌陷并释放压力。

使用精细镊子或金属探针，轻轻将胚胎从孔中推出，使卵黄膜仍附着在双面胶带上。将不需要的胚胎留在胶带上。定期使用玻璃巴斯德移液管收集任何漂浮的去卵黄膜胚胎，并将其转移至1.5毫升微量离心管中。

在50毫升锥形管中配制PDMS溶液，并在另一支50毫升锥形管中加入适量水以配平。在15摄氏度下，以500×g离心PDMS溶液3分钟。随后将其倒入直径10厘米的培养皿中，厚度为1毫米。

将PDMS溶液在55摄氏度下静置过夜使其固化。PDMS平板固化后，使用手术刀划出略小于22毫米×22毫米盖玻片的方形区域。在每个方形区域内，再划出并移除一个宽8毫米的方形孔洞。

将每个方形PDMS小室转移至22 mm × 22 mm的盖玻片上，并牢固粘附。为将胚胎粘附到盖玻片上，向每个小室内的盖玻片表面加入足量0.1%聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine），使其完全覆盖表面，随后置于55°C培养箱中干燥。用PBS短暂漂洗胚胎，以去除Tween去污剂。

然后将10个以上的胚胎转移至每个经多聚-L-赖氨酸包被的孔中。让胚胎沉降至孔底。用巴斯德移液管吸除黏附胚胎周围的多余液体，并立即进行下一步操作。

在胚胎置于单体溶液中的同时，准备凝胶溶液以覆盖PDMS孔。将催化氧化剂从粉末中新鲜稀释。将3,920微升单体溶液与60微升10%TEMED和20微升1%TEMPO混合。

将凝胶溶液分装至多个PCR管中，每管125微升。使用真空泵或移液器小心地从PDMS孔中移除单体溶液，注意不要破坏胚胎。向其中一管含有凝胶溶液的PCR管中加入5微升APS，以启动聚合反应。

迅速将正在聚合的凝胶溶液分配到三个孔中。重复此操作，直至所有孔和胚胎均被覆盖。将样品在37摄氏度下静置凝胶化1.5至2.5小时。

较厚的水凝胶需要更长时间才能完成聚合并固化。应经常振荡水凝胶以监测聚合过程。一旦固化，水凝胶将不再晃动。

凝胶化后，将PDMS小室从盖玻片上小心剥离，避免扰动水凝胶。将水凝胶逐个转移至六孔板的孔中。水凝胶在消化过程中可能会轻微膨胀。

用消化缓冲液完全覆盖凝胶。在六孔板中，30 毫升消化缓冲液足以覆盖凝胶，并在 37 摄氏度下孵育一小时。消化后，将水凝胶转移至一个六厘米的培养皿中，并加入去离子水使其膨胀。

此时，水凝胶可能会从盖玻片上脱落，并在线性尺寸上膨胀至原来的四倍。使用巴斯德吸管尽可能移除培养皿中多余的水分，以尽量减少操作时凝胶的移动。将带有胚胎且位于底面的膨胀凝胶转移至一张较大的盖玻片上，以便成像。

将每张盖玻片用凝胶封固后，置于倒置激光扫描共聚焦显微镜的物镜上方。先定位到处于合适发育阶段且方向正确的样本，随后切换至高倍油镜或水浸物镜，以高分辨率进行成像。在10倍物镜下沿胚胎头尾轴测量其长度，结果显示未扩张的胚胎约占据半个视野，而扩张后的胚胎则大约横跨两个完整的视野。

未扩张对照组胚胎的头尾平均长度为398.8微米。实验一、实验二和实验三中，胚胎的平均长度分别为对照组的4.0倍、4.7倍和4.9倍。在对照样本中，上颌节段细胞的平均宽度为4.76微米。

在扩增的样本中，上颌节段细胞的平均宽度为19.10微米，代表了4.0倍的扩增。在未扩增的对照组与发生汇聚延伸的扩增胚胎中均对肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架进行了成像。它们在相邻细胞相接处呈现为一条单线。

相比之下，在扩张的7期胚胎中，可在细胞间连接处观察到成平行排列的肌球蛋白II，代表相邻细胞中的皮层蛋白聚集区域。在未扩张的6期胚胎中，经链霉亲和素标记的线粒体呈现为异质性的细胞质弥散信号，无明显的亚细胞结构细节。然而，在扩张的胚胎中，细胞质内可分辨出大量点状结构，可能代表断裂的线粒体或线粒体网络的片段。

进行此操作时需要牢记的一个重要事项是，在二抗孵育后应保护胚胎免受过度光照。