Caenorhabditis elegans 生殖系中联会复合体的超分辨率显微成像

联会复合体是减数分裂的关键组分。为了研究其功能，我们还必须了解其结构，而超分辨率显微镜已被证明在这一方面极为有用。我们优化了实验方案，能够将免疫染色的秀丽隐杆线虫（C. elegans）性腺稳定地附着在盖玻片上，从而在完整组织中将分辨率提高至30纳米。

单分子定位显微镜实验的设计、后续分析以及数据的解读可能具有相当大的挑战性，最好与专家共同完成实验方案的制定。本实验操作将由实验室的博士前研究员伊瓦娜·卡夫卡（Ivana Cavka）进行演示。单分子定位显微镜图像的采集过程将由海洋生物实验室成像中心的光学工程师罗里·鲍尔（Rory Power）展示。

从NGM琼脂平板上挑选年龄相匹配的秀丽隐杆线虫。将线虫转移至盖玻片上30微升EBTT液滴中。用额外的30微升EBTT洗涤线虫。

移除30微升溶液，使盖玻片上留下含有线虫的30微升液滴。使用手术刀片切下线虫的头部和/或尾部，以挤出性腺。在成功的解剖操作中，性腺组织将完全从线虫体内挤出。

用移液器将30微升固定液加入解剖后的线虫液滴中。通过移液混匀，并让样品固定1分钟。恰好1分钟后，用20微升移液器将线虫转移至含有TBST的PCR管中，以终止固定。

然后使用小型台式离心机对解剖后的样品进行洗涤。去除上清液后，将线虫重悬于 200 µL 新鲜的 TBST 中。最后一次洗涤后，将线虫重悬于 200 µL 的 PBST 中，并将 PCR 管置于冰上。

将解剖后的样品在小型台式离心机上离心，并移除上清液。加入50至100 µL预冷的甲醇，用移液器吹打混匀，将样品置于冰上静置30至60秒。用200 µL PBST洗涤样品两次。

离心样品并去除上清液后，向样品中加入封闭液，在室温下孵育45至60分钟。用封闭缓冲液将一抗稀释至工作浓度。将样品在小型台式离心机上离心，去除封闭液，然后加入30至50微升一抗溶液。

在4°C下孵育过夜。孵育结束后，用PBST洗涤样品三次。用封闭缓冲液将标记的Fab'2片段稀释至工作浓度。

第三次洗涤后，离心样品，弃去上清液，加入30至50微升二抗溶液。将样品置于避光容器中，在室温下孵育30分钟至2小时，或在4摄氏度下孵育过夜。随后用PBST洗涤样品三次，每次5至15分钟。

将染色后的样品离心并弃去上清液。加入50 µL PBST，将染色的线虫转移至盖玻片上。用移液器吸取5.7至6.3 µL固定后溶液，滴加到多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上。

用相同体积的移液器将解剖后的线虫转移至多聚赖氨酸包被的盖玻片上的固定液滴中。用一小块盖玻片覆盖样品。用一小片滤纸吸去多余液体，并在避光环境中固定三至五分钟。

将样品置于干冰上的铝块中进行冷冻。至少20分钟后，使用刀片取下较小的盖玻片。将盖玻片浸入含有预冷磷酸盐缓冲液（PBS）或在-20°C下冷藏的甲醇的50毫升锥形管中，约10秒钟。

将盖玻片放入盛有PBST缓冲液的六孔板的一个孔中。移除孔中的PBST，加入新鲜PBST，并将样本孵育五分钟。再次用PBST洗涤后，将样本置于四摄氏度保存，直至成像。

成像前，在体视显微镜下评估样品固定的质量。若使用此处所示的自制样品 holder，请先用 Parafilm 将磁环包裹，然后准备一毫升成像缓冲液。从六孔板中取出盖玻片。

将其放入定制的样品 holder 中，并用包裹了封口膜的磁性环将盖玻片固定在 holder 上。轻轻将成像缓冲液加入由磁性环在样品上方形成的腔室中，然后用封口膜密封腔室。安装样品时，在洁净的油镜物镜上滴加一滴浸油。

在不引入任何空气的情况下，将载有样品的样品 holder 轻轻放置在显微镜载物台上。在 MicroManager 2 中使用 EMU 插件窗口，移动压电载物台，直至在四象限光电二极管上检测到聚焦锁定激光的信号。使用 640 纳米激发激光在较低功率下采集后焦平面图像，以确认浸油中无气泡存在。

使用明场照明定位性腺组织。采用640纳米波长的低强度照明，聚焦于含有大量联会复合体的组织切片。随后，用640纳米波长的高强度光照照射样品约30秒，直至达到适当的闪烁频率。

使用 MicroManager 2 中的多维采集工具，以 20 毫秒的曝光时间采集 200,000 帧图像。同时，利用 EMU 插件的激活选项设置紫外光激活，以维持所需的闪烁速率。通过 HTP-3 和 SYP-5 染色，在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）性腺中观察到包含联会复合体的减数分裂细胞核的最底层平面。

在靠近盖玻片的联会复合体中，SYP-5 HA 的 C 末端染色体轴在三个维度上均能清晰分辨。然而，当联会复合体距离盖玻片五微米时，由于光散射和球面像差，分辨率下降。在不同压电位移距离下采集的图像显示，成像组织与盖玻片的距离不应超过两微米。

该样品制备方案也可用于TauSTED显微镜成像。通过优化的样品制备，可在正面及轻微倾斜视角下清晰分辨染色体轴上的HTP-3以及联会复合体中央区域SYP-5的C末端。为获得最佳分辨率，必须将性腺紧密交联固定于盖玻片上，以确保联会复合体与盖玻片的距离不超过两微米。

我们不仅将此方案用于单分子定位显微镜，也用于受激发射损耗显微镜。该方案可能对其他超分辨率显微镜技术也有帮助。