纳米颗粒与纳米结构表面抗菌活性的评估 体外

这些方案提供了一种方法，可用于从初步研究到更复杂的表面检测，全面评估纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性。与以往导致不同研究间数据无法比较的方法不同，这些方法在不同纳米颗粒材料、纳米结构材料以及微生物种类之间均能产生一致且可比较的结果。在方法A和方法B中，维持纳米颗粒的均匀分布可能较为困难。

充分涡旋混匀样品可确保纳米颗粒悬浮，分装时在各份样品之间移液三到四次可维持悬浮状态。开始收集培养的细菌时，将过夜培养的菌液一毫升分装至1.5毫升微量离心管中。制备足够数量的分装样品后，进行离心以达到所需的沉淀密度。收集上清液至收集容器中。

将细胞沉淀重悬于 0.5 毫升新鲜培养基中。合并两支试管中的悬液，并重复离心。离心后，用新鲜培养基进行第二次洗涤，并在离心前再次将两支试管中的内容物合并为一支。

用 0.33 毫升 Tris 缓冲液或羟乙基氨基甲烷缓冲液进行第三次洗涤。将三份体积均为 0.33 毫升的悬浮液合并至一个 1.5 毫升微量离心管中。离心后，弃去沉淀细胞的上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升新鲜 Tris 缓冲液中，所得液体称为细胞悬浮液或对数生长期细菌接种培养物。

为制备细菌与纳米颗粒的培养物，将两毫升细菌种子培养液分别加入12孔未经组织处理的聚苯乙烯板的每个孔中。对于每个含有预先称重的氧化镁颗粒的五毫升微量离心管，加入三毫升细菌种子培养液，并短暂涡旋振荡管子，使氧化镁纳米颗粒与细菌充分混合。

混合后，取一毫升氧化镁纳米颗粒悬浮液，分别加入三个独立的孔中，为每种预称重的氧化镁纳米颗粒制备三个重复样品。在37摄氏度、120 rpm条件下孵育过夜。然后用移液器将三毫升样品转移至一个15毫升的锥形管中。

然后在96孔板中进行1到10倍的系列稀释：根据所需列数，在B至G行的每孔中加入180微升Tris缓冲液。短暂涡旋含有细菌样品的15毫升锥形管，取50微升细菌样品加入A行的单个孔中。接着，从A行开始，将20微升细菌样品转移至B行对应孔中，并短暂混匀。使用无菌移液器吸头，将B行孔中的20微升液体转移至C行对应孔中。依此操作继续至G行，完成系列稀释，使稀释倍数从B行的10⁻¹至G行的10⁻⁶。完成后，将每孔中的100微升液体移取至相应的生长琼脂平板中，并在平板上均匀涂布，以分散细胞培养物。

将培养板放入37摄氏度的摇床培养箱中过夜，同时将琼脂平板在37摄氏度下培养24小时。观察平板，计数含有约25至300个菌落的平板。如有可能，选择相同稀释度的平板。

针对每种待测材料，将过夜培养的细菌样品进行稀释，取三份各200微升的菌液加入到培养基中，分别放入三个孔内；另取三份各200微升的细菌培养物加入到其他孔中。将96孔板放入酶标仪中进行扫描。如有必要，继续添加培养基或过夜培养的细菌，直至600纳米波长处的光密度（OD 600）达到约0.01。

为制备细菌-纳米颗粒悬浮液和无菌培养基-纳米颗粒悬浮液，从三组15毫升锥形管中各取出1毫升细菌培养物或培养基，加入含有预先定量纳米颗粒的5毫升离心管中。涡旋振荡各管以充分混匀溶液。

通过将5毫升离心管中的1毫升等分试样转移至15毫升锥形管中，使纳米颗粒均匀分布。完成后，将每份样品200微升分装至96孔板的各个孔中。在确定前述的接种密度后，将样品和对照加入48孔未经组织处理的聚苯乙烯板的各个孔中。

接下来，将0.75毫升的细胞悬液分装至含有样本和对照的每个孔中。将48孔板放入振荡培养箱中，在37°C、120 RPM条件下振荡培养24小时。培养结束后，从每组中分别收集两个样本，并将其单独转移至已标记的5毫升微量离心管中。

向每支试管中加入两毫升改良模拟体液（RSBF）。将硝酸纤维素膜剪成直径一厘米的圆形，制备成无菌滤纸片。将剪好的硝酸纤维素膜放置于含有适当培养基的琼脂平板上。

接下来，将50 µL稀释后的细菌培养物加到滤纸上，然后在每个样品表面的中心加入50 µL适当的培养基。使用已灭菌的镊子从螺旋管表面取下硝酸纤维素膜，小心地将其翻转并放置在样品表面，使细菌与50 µL培养基以及目标纳米结构表面接触。

如果样品在培养过程中易降解，则在其下方放置一个支撑物以托起样品，避免与Tris缓冲液接触。通过向含有样品的孔中加入一毫升Tris缓冲液来保持湿度。经过过夜孵育后，从每个样品表面收集硝酸纤维素膜，并将其放入五毫升Tris缓冲液中。

将收集的滤纸和纳米表面材料样品涡旋振荡五秒钟。收集样品中的Tris缓冲液悬浮液，并将其分别放入新的收集管中。采用方法A检测的抗菌效果显示，氧化镁纳米颗粒对革兰氏阴性菌大肠杆菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为1.0毫克/毫升和1.6毫克/毫升，最小杀菌浓度（MBC 99.9）分别为1.0毫克/毫升和1.6毫克/毫升。

革兰氏阳性菌表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对氧化镁纳米颗粒的最低抑菌浓度（MIC）值分别为 0.5、0.7 和 1 毫克/毫升。表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的 NBC 99.99 值分别为 1.6 和 1.2 毫克/毫升。而 MRSA 未达到 NBC 90 以上的减菌效果。

在药物敏感和耐药的念珠菌物种，即白色念珠菌（C. albicans）和氟康唑耐药的白色念珠菌（C. albicans fluconazole resistant，FR）中，最低抑菌浓度（MIC）分别为1.2和1毫克每毫升。相比之下，氧化镁纳米颗粒对光滑念珠菌（C. glabrata）和棘白菌素耐药的光滑念珠菌（C. glabrata echinocandin resistant，ER）的MIC值分别为1和0.7毫克每毫升。每种候选菌株的最低杀菌浓度90（NBC 90）为0.7至1.2毫克每毫升，但只有光滑念珠菌ER在1.2毫克每毫升时被降低至NBC 99.9。

在方法B中，暴露于纳米颗粒的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）呈指数生长，OD值达到0.85。暴露于1.2毫克/毫升的氧化镁纳米颗粒和6.25毫克/毫升的甲氧苄啶后，细菌生长分别减少了80.2%和81.6%。同样，2.9毫克/毫升的氢氧化镁纳米颗粒使细菌生长减少至70.3%。暴露于1微升/毫升的万古霉素后，MRSA的生长减少了99.99%，表明氧化镁和氢氧化镁纳米颗粒具有抑菌活性。

方法C在间接接触条件下未显示出对细菌生长的抑制作用。结果表明，在所有测试样品中，ZC21对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的黏附和生长具有最强的抗菌活性。在方法D中，1.9A、1.9 AA和EPD样品及其配对的滤纸中均未检测到存活的金黄色葡萄球菌。

然而，跪姿接触EPD样品后，纳米结构表面及配对滤纸上的细菌生长被抑制至仅存少数细胞。纳米颗粒与纳米结构表面抗菌活性的发现，已推动了生物工程应用领域的进一步研究，包括与慢性伤口及植入物相关感染有关的应用。