通过纳米颗粒追踪分析与高通量流式细胞术评估聚合物基因递送纳米颗粒

本实验的总体目标是利用非病毒聚合物纳米颗粒进行基因递送实验，并对其效果进行评估。首先将基因递送颗粒转染入细胞，随后通过显微镜观察及高通量流式细胞术分析来评估转染效率。

接下来，使用纳米颗粒追踪分析仪器测定纳米颗粒的粒径分布浓度以及每个颗粒所含质粒的数量。最终，该方法可实现对纳米颗粒粒径的表征以及利用纳米颗粒进行转染效率的评估。采用可生物降解的聚合物纳米颗粒进行基因递送的主要优势在于，与其他基因转移方法相比，其安全性更高且更有效。

与动态光散射等现有方法相比，纳米颗粒追踪分析的主要优势在于其能够直接提供数均粒径分布和颗粒浓度。该方法有助于回答非病毒基因递送领域中的关键问题，例如每个颗粒所携带的质粒数量，这对于共表达研究具有重要意义。以下实验方案以人视网膜内皮细胞（hre）作为模型细胞，聚β-氨基酯（PBA AEs）作为模型聚合物进行演示。

请注意，根据所使用的细胞和聚合物，转染前 24 小时可能需要调整培养条件和溶剂。使用多通道移液器将 hre 接种到透明的组织培养处理过的平底 96 孔板中，接种浓度为每微升 25 至 50 个细胞。

转染当天应达到70%至80%的融合度，准备并标记未经过组织培养处理的透明96孔板，用作主板以配制和稀释PBA及DNA。将准备两块相同的板。

一个用于评估毒性，另一个用于评估转染效率。将聚β-氨基酯（PBAE）或PVAE聚合物以及P-E-G-F-P-N 1D DNA储备液置于室温下。解冻后，使用12通道移液器为每种条件准备一个孔，其中含有50微升浓度为0.06毫克/毫升的DNA溶液，溶于25毫摩尔/升的醋酸钠缓冲液中。

在同一块板上，将 PBAE 聚合物用醋酸钠缓冲液稀释至 10 毫克/毫升。然后进一步将 PBAE 聚合物稀释成聚合物质量与 DNA 质量比为 30 和 60 的溶液，每份体积为 50 微升醋酸钠缓冲液。为形成纳米颗粒，使用 12 通道移液器将 50 微升稀释后的 PBAE 与 50 微升稀释后的质粒 DNA 混合，并通过上下吹打剧烈混匀。

然后将混合物在室温下孵育10分钟，以使纳米颗粒自组装。自组装完成后，使用12通道移液器将20微升纳米颗粒溶液逐滴加入含有培养基的接种细胞孔中，每种条件转染四个孔，如本图所示。每块板需为阴性对照和阳性对照各预留至少四个孔。

阴性对照包括未处理的细胞，阳性对照则包括使用商用转染试剂（如 Lipo 2000 或 Fuge HD）转染的细胞。将转染后的细胞板在 37 摄氏度条件下孵育 4 小时。孵育结束后，使用 12 道移液器移除细胞中的培养基，并每孔加入 100 微升新鲜的 hre 培养基，继续孵育 24 至 48 小时。

第二天，从培养箱中取出一块培养板。通过荧光显微镜评估细胞转染效率和细胞毒性，并按照随附文本所述，使用细胞滴定96水溶液一法（cell titer 96 aqueous one assay）对细胞毒性进行定量。48小时后，从培养箱中取出另一块培养板。

通过荧光、显微镜和流式细胞术评估转染效率，具体方法见随附文本。利用此处获得的毒性及转染数据，确定后续实验中PBA的最佳使用浓度。Nano Sight NS 500 是一种纳米颗粒追踪分析仪器，可通过追踪单个纳米颗粒的扩散情况，提供纳米颗粒样品的粒径分布信息。在使用前，需用0.5毫升微量离心管对Nano Sight的流体系统进行预处理。

按照本视频前一节中使用的相同浓度，准备用于分析的PBA和血浆DNA。自组装完成后，在新的1.5毫升离心管中用PBS将纳米颗粒溶液稀释100倍，以获得至少500微升的终体积。这将使纳米颗粒浓度处于纳米颗粒示踪分析的合适范围内。

接下来，将样品加载到纳米检测位点。注意避免引入气泡，并通过肉眼检查确保屏幕上显示的颗粒数在20至100之间。进行纳米颗粒追踪时，理想的颗粒数量约为50个。

如果颗粒数量过多或过少，需用 NS 500 缓冲液冲洗，调整 PBS 中的稀释比例后重新上样。若屏幕上颗粒数在 20 至 100 之间，则开始录制视频。视频采集完成后，通过在同一软件中打开视频文件，进入后续处理阶段。

然后，文件打开后，增加屏幕增益。通过勾选相应的选项框，选择图像参数的自动调节。如果软件识别出屏幕上的颗粒，将会用红色十字标记。

标记完所有颗粒后，点击软件中的“处理”按钮以处理视频文件。随后将显示颗粒大小、分布大小平均值及颗粒浓度，以验证颗粒计数的准确性。使用同一份样品，分别稀释两倍和四倍后，重复此操作步骤。

如本视频所示，PBS中的细胞被转染了E-G-F-P-P-B-A-E纳米颗粒。为直观评估转染效率，进行了荧光显微镜成像。这些图像显示了转染细胞的荧光、明场及合并图像。如合并图像所示，大部分细胞表达了EGFP，并保持了正常的形态。

为了定量转染效率，对活细胞群体进行门控后，通过流式细胞术进行了分析，结果如图所示。未处理的群体中未检测到EGFP阳性细胞。然而，71.6%的处理细胞呈EGFP阳性。随后采用纳米颗粒示踪分析（nanoparticle tracking analysis）测定纳米颗粒的粒径分布和浓度。

进行此分析时，确保粒径分布为单分散性至关重要。利用该信息，可通过将溶液中质粒的浓度除以NS 500测定的颗粒浓度，计算出每个颗粒所含质粒的平均数量。每个颗粒所含质粒的数量分布反映了颗粒的粒径分布。

在样品中，会存在一些较大的颗粒，其每个颗粒所含质粒数高于平均值，同时也会存在一些较小的颗粒，其每个颗粒所含质粒数低于平均值。在进行该操作时，需注意避免将可降解聚合物在水相溶剂中放置过久，以免在将纳米颗粒加入细胞前发生降解；若用于粒径测定，应调整至适合粒径分析的稀释比例。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用非病毒基因递送聚合物对贴壁细胞类型进行转染，以及如何测定转染效率和颗粒粒径分布。

请勿忘记，操作人类细胞具有生物危害性。进行此操作时，务必穿戴个人防护装备，并在生物安全柜内操作。