人类卵泡中的基因表达分析
2023年2月17日
本文介绍了一种从冻融后的卵巢皮质组织中分离人卵巢卵泡以进行基因表达分析的实验方案。
本方案描述了一种高效分离卵巢卵泡及其周围基质细胞的方法，用于对这些生殖细胞进行基因表达分析。该技术结合了可控的酶消化与机械分离，可在保持卵泡完整性的前提下实现其有效回收。按照本方案操作后，研究人员可对这些细胞中的特定基因表达水平进行评估。
该技术可用于进一步了解与影响卵巢功能的疾病或暴露于毒性物质后卵泡中基因表达缺陷相关的机制。开始准备六孔板，向第一孔加入5毫升冷冻保护剂溶液，向接下来的四个孔中分别加入含递减浓度冷冻保护剂的Leibovitz 15培养基各5毫升。按照安全规范，从液氮中取出含有卵巢皮质组织片段的小管。
室温或 RT 下静置 30 秒后，将小瓶浸入双蒸水中两分钟。在垂直层流罩内，轻轻振荡并打开卵巢皮质碎片小瓶，然后将内容物转移至置于冰上的六孔板的第一个孔中。接着，将第一个孔中的卵巢皮质碎片依次转移至六孔板的各个孔中，每个孔均含有 5 毫升 Leibovitz 15 培养基，其中 cryoprotectant 浓度逐孔递减。
在每种培养基中轻轻振荡组织五分钟。进行卵泡分离时，将解冻的卵巢组织转移至含有10毫升解剖培养基、30微克/毫升青霉素G和50微克/毫升链霉素的2毫米网格化培养皿中。如有必要，用手术刀调整组织大小。
将组织切片器的三个部件叠放在一起，将卵巢碎片置于两个模块之间。使用刀片沿模块滑动切割，将碎片切成两半，得到两块厚度为0.5毫米的组织块。再使用组织切碎器将组织切割成更小的片段。
如有必要，用手术刀手动切碎剩余组织，直至组织完全破碎。组织破碎后，立即将碎片转移至含有七毫升消化液的带网格的培养皿中，并将培养皿置于含5%二氧化碳、37摄氏度的培养箱中。每隔10分钟从培养箱中取出培养皿一次。
用1毫升移液器反复吹打消化液以冲洗组织。在消化液中孵育45分钟后，将培养皿置于体视显微镜下，放大倍数为5至6.3倍，使用微毛细移液管回收卵泡。选择目标卵泡，并用口吸移液管将其吸出分离。
如果卵泡仍附着在皮质组织碎片上，可使用两支27号注射器通过针尖撕脱皮质组织，将卵泡从基质中机械分离。利用微毛细管将分离的卵泡转移至四孔板中，每孔含15 µL校准培养液，并覆盖500 µL培养用油。每转移1至10个卵泡后，将其在两滴各含15 µL PBS（每滴均覆盖500 µL培养用油）中各清洗两次，每次5秒。
使用口吸管将20个卵泡连同少量PBS收集到一个空管中，并将试管置于冰上。在消化液中孵育90分钟后，加入冷阻断液以终止酶促反应。在通风橱内，将分离的卵泡悬浮于100微升RNA提取试剂盒提供的裂解液中。
将分离的卵泡在2500转/分钟下涡旋震荡，以破坏其结构，然后向离心管中加入50微升100%乙醇。高速短暂涡旋离心管。震荡后，将管内全部液体转移至微型滤膜 cartridge 组件中，该组件包含一个层析柱和一个收集管。
在4°C条件下，以16,363 ×g离心组装体10秒。将试剂盒中提供的180 µL洗涤液1加入柱中，洗涤后于相同条件下离心10秒。随后用180 µL洗涤液2和洗涤液3各洗涤柱两次，最后一次离心以干燥滤膜，然后在柱下放置一个新的收集管。
为了进行核酸的洗脱，首先向滤膜组件中加入8 µL 75 °C的洗脱液。静置1分钟后，将组件以30秒离心。用7 µL洗脱液重复此步骤一次。
完成后，向离心管中加入2个国际单位的DNase及DNase缓冲液，在37摄氏度下孵育20分钟。在室温下用10倍体积的DNase失活试剂处理2分钟，以阻断酶活性。随后，在4摄氏度下以16,363 ×g离心1.5分钟，将含有RNA的上清液转移至新的离心管中。
使用分光光度计测定样品中RNA的含量。以1微升洗脱液作为空白对照，以1微升从分离的卵泡中提取的RNA溶液作为检测样品。检查260/280比值是否约为2.0，以评估RNA纯度。
将样品储存于 -80 摄氏度，或直接进行逆转录以开展 RT-qPCR。采用本方案，将同一患者两个大小为 4×2×1 毫米的卵巢组织匀浆片段用于卵泡分离。RNA 定量结果显示，从直径小于 75 微米的卵泡中提取的总 RNA 浓度为 4.8 纳克/微升，纯度比值为 1.89。
从直径小于200微米的卵泡中，提取得到10.5纳克/微升的总RNA，其纯度比值为1.74。1号和2号管的RNA完整性数值（RIN）分别为7.1和7.9，证实了我们样本中RNA的质量。在实时PCR系统上运行标准循环后，HPRT的循环阈值（CT）分别为30.87和29.56，kit配体分别为33.5和31.77，GDF9分别为30.71和30.57。
组织的酶消化过程是一个关键步骤。实验人员必须在反应过程中持续评估并确保卵泡的完整性，并在必要时及时终止反应。除了用于基因表达分析外，分离得到的卵泡还可用于开发旨在保护癌症患者生育能力的实验系统，例如卵泡体外培养或人工卵巢。
分离技术需要一定的学习过程，才能获得较大量的完整卵泡。建议研究人员在消化前确保组织已被充分破碎。
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概述
本方案描述了一种从冻融的皮质组织中高效分离卵巢卵泡以进行基因表达分析的方法。该技术在保持卵泡完整性的前提下，可实现特定基因表达的评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生殖生物学
背景
- 卵巢卵泡对生殖功能至关重要。
- 基因表达分析可揭示卵巢健康的内在信息。
- 分离技术对于维持细胞完整性至关重要。
- 了解基因表达缺陷有助于疾病研究。
研究目的
- 分离人卵巢卵泡以进行基因表达分析。
- 评估疾病及毒性物质对卵泡功能的影响。
- 为生殖生物学领域的研究人员提供可靠的实验方案。
使用的方法
- 受控的酶解和机械分离技术。
- 含冷冻保护剂溶液的六孔板制备。
- 卵巢皮质组织碎片从液氮中的取出与处理。
- 分离卵泡中基因表达水平的评估。
主要结果
- 成功分离卵巢卵泡并保持其完整性。
- 能够对分离的细胞进行基因表达分析。
- 深入了解与卵巢功能相关的基因表达。
- 在理解卵巢疾病方面具有潜在应用价值。
结论
- 该方案提供了一种可靠的卵泡分离方法。
- 它能够实现卵巢研究中基因表达的详细分析。
- 未来的研究可进一步探讨其对卵巢健康的潜在意义。
常见问题
执行层面的行业相关性
对分离的人类卵巢卵泡进行精确的基因表达分析，能够实现生殖靶点的机制性风险评估，并支持卵巢功能障碍相关的转化研究。本方案可从特定的卵泡群体中获得高完整性的RNA，增强早期发现和疾病建模中的预测可靠性。该方法直接适用于生殖生物学及生育力保存研究中的项目决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在疾病或毒物暴露条件下，检测分离的生殖细胞中基因表达的变化。
- 在分离过程中保持卵泡完整性，支持功能靶点的验证。
- 有助于对生殖通路靶点进行机制性风险评估与降低。
筛选与检测方法开发
- 提供标准化、可重复的卵泡分离方法，适用于下游 RT-qPCR 检测。
- 产出适用于检测校准与验证的定量 RNA 结果。
- 制备高质量的生物样本，用于可靠的化合物或毒性物质筛选。
转化与临床前研究
- 将基因表达谱与疾病相关的卵巢模型进行比对。
- 支持从分子发现到生育力保存研究中临床前验证的连续性。
- 促进生殖健康干预措施的基于风险评估的推进。
流程与工作流整合
本方案通过实现完整卵泡的分离以进行基因表达分析，将研究贯穿于从发现到临床前的全过程，支持卵巢生物学中的靶点验证和转化研究。
- 发现生物学：支持对疾病或暴露于毒性物质的卵泡中基因表达缺陷的假设验证。
- 筛选：提供可重复、定量的RNA，适用于基于RT-qPCR的检测方法开发。
- 分析：提供RNA纯度和完整性指标（如RIN值、260/280比值），以实现可靠的数据比较。
- 转化研究：将分子研究结果与临床前生育力保存模型相联系。
- 企业级复用：建立可重复使用的卵泡分离工作流程，适用于多种卵巢研究项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高基于基因表达的靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：标准化卵泡分离与RNA提取流程，以获得可重复的结果。
- 战略价值：降低机制上的不确定性，支持生殖研发领域中合理的“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：实现对生育力与卵巢健康项目的基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备组织处理、酶消化和显微解剖方面的专业知识。
- 需要使用 specialized instruments（组织切片机、切块器、显微毛细移液管、RT-qPCR 平台）。
- 要求各团队之间进行严格的标准统一，以确保卵泡完整性和RNA质量。
- 针对不同卵泡大小或组织来源，可能需要进行方法调整。
- 必须密切监测消化过程，以防止卵泡结构退化。
