从人窦状卵泡中提取、标记和纯化谱系特异性细胞

本实验方案可实现对卵巢卵泡中从早期有腔阶段开始存在的特定细胞谱系进行标记和分离，从而实现高分辨率分析与培养。这一高精度方法利用荧光素偶联抗体组合，靶向在颗粒细胞、间质细胞及膜细胞谱系中稳定且特异性表达的细胞表面标志物。首先将卵巢置于无菌培养皿中，加入预冷的培养基浸润组织，确保卵巢一半浸没在培养基中。

去除任何缝线或其他材料，并将卵巢周围的残留组织剥离。为分离窦状卵泡，需识别单个卵泡并选择形态健康的卵泡。排除任何充血、颜色发暗或形态不对称的卵泡。

使用手术刀从卵巢中分离选定的窦状卵泡，保持卵泡腔完整，并切除包围卵泡的皮质组织。将每个完整切除的窦状卵泡置于六孔板的一个孔中。将尺子置于培养皿下方，测量卵泡直径以用于描述性分析。

使用手术刀将完整的窦状卵泡切开，以观察窦腔，并加入6毫升酶解细胞分离培养基，然后将培养板置于湿润的培养箱中孵育10分钟。孵育结束后，加入6毫升含有20%胎牛血清（FBS）的培养基，使用P-1000移液器反复剧烈吹打切开的卵泡区域，用培养基冲洗。随后，收集培养基，并通过100毫米滤膜过滤。

离心前，将过滤后的上清液在 300 G、4 °C 条件下离心 3 分钟，然后吸走上清液。将剩余组织置于含有 100 单位/毫升胶原酶和 1 单位/毫升中性蛋白酶的平衡盐溶液混合液中，孵育 30 分钟。在孵育 10 分钟和 20 分钟后，分别通过吹打和剧烈移液两次对组织进行机械性破碎。

操作完成后，回收组织，使用 P-1000 微量移液器枪头反复吹打冲洗，并通过 100 毫升滤器过滤。将过滤后的组织在 300 ×g、4°C 条件下离心 3 分钟，随后将富含卵泡膜细胞和基质细胞的细胞沉淀置于冰上，用于标记和流式细胞分选（FACS）。为鉴定颗粒细胞和卵泡膜细胞，将细胞沉淀重悬于含有直接偶联抗体的封闭液中，在 4°C 孵育 10 分钟。

洗涤并离心细胞后，将细胞重悬于含有4-6二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的FACS缓冲液中，并通过FACS仪器对细胞悬液进行分选，利用荧光标记抗体的荧光强度圈选并获取少量细胞群体。将剩余的卵巢组织沿中线切开，使用弯头精细剪刀和手术刀切除髓质，注意避免损伤卵巢皮质。

通过轻柔刮除继续处理并削薄卵巢皮质，直至残留的髓质最少。沿卵巢长轴将皮质组织切成2至3毫米宽的条状。进行卵巢组织冷冻时，将每条皮质组织放入预冷的冻存液中，每个冷冻小管中放置一条。

将含有皮质条的冻存管置于旋转板上，在4°C条件下振荡20分钟。用浸入液氮中片刻的棉签轻轻接触每个冻存管，以诱导冰晶成核。收集卵巢细胞，并通过流式细胞分选技术（FACS）从窦状卵泡中分离细胞组分，纯度超过95%。

CD99 特异性标记颗粒细胞，在 PVRL1 或 nectin 中，随着窦状卵泡体积增大，其在卵丘颗粒细胞区的定位逐渐增强。研究发现，抗内皮糖蛋白或 CD55 的抗体可特异性界定所有间质细胞和卵泡膜细胞，而丙氨酸氨基肽酶则特异性表达于产生雄激素的卵泡膜细胞。通过使用靶向 CD99 的抗体标记颗粒细胞，并采用抗 CD45 抗体排除造血细胞。

针对PVRL1的抗体将颗粒细胞群体分离为卵丘和壁层两个区室。在使用胶原酶-分散酶进行酶消化后，通过CD55、CD34和丙氨酸氨基肽酶抗体标记细胞悬液，可特异性捕获所有基质或膜细胞，或雄激素生成性膜细胞，同时排除膜细胞群体中的内皮细胞。在初始卵泡分离过程中，应特别注意避免破坏卵泡的腔隙结构，切割时应在卵泡边界周围保留安全边缘。

在此操作之后，细胞可用于分子或诊断分析，也可在体外培养，用于毒理学研究、实验分析或卵泡微环境的重建。迄今为止，这些方法已被用于建立涉及卵巢的内分泌紊乱模型，并鉴定出与卵泡相关的新型细胞亚群。