基于免疫染色的红细胞蛋白质动态变化检测

本方法通过原位固定瞬时的蛋白质修饰，并利用特异性抗体对其进行检测，从而在快速发展的力学生物学领域实现了机制性的亚细胞水平研究。该方法在技术上易于操作，结果具有高度的有效性和可重复性。

此外，与其他技术相比，我们的方法可有效应用于新兴的红细胞翻译后信号传导研究领域，该领域依赖于短暂的蛋白质修饰，特别是红细胞机械信号传导。进行红细胞蛋白质固定时，将全血按1:2的比例稀释于4%多聚甲醛溶液中，在室温下孵育20分钟。在室温下以132 g离心血液溶液3分钟，并小心移除上清液。

用两倍体积的0.1摩尔PBS重悬红细胞沉淀，在室温下孵育5分钟。再次离心样品，弃去上清液，然后用一倍体积的0.1摩尔PBS重悬红细胞沉淀。使用耐酒精记号笔在显微镜载玻片上标记样本编号及所用抗体。

加入10 µL制备好的红细胞溶液。将第二张载玻片以45度角放置在样品上，并沿载玻片均匀分散样品。通过将载玻片样品在本生灯火焰上方持续移动5至7秒，进行热固定。

进行免疫组织化学染色时，使用记号笔将载玻片的2/3区域标记为检测区，1/3区域标记为对照区。随后用TBS冲洗样本区域两次，每次30秒。第二次冲洗后，加入0.1%胰蛋白酶，并使用带盖的专用孵育盒覆盖载玻片。

将样品在37摄氏度下孵育30分钟。用烧杯接取自来水，将烧杯中的自来水加入载玻片以终止酶反应。倒掉溶液，并用TBS洗涤两个区域各三次。

最后一次洗涤后，加入过氧化物酶阻断液，在室温下孵育30分钟。孵育结束后，倒去溶液，并用TBS洗涤两个区域各三次。然后加入3%脱脂奶粉溶液，孵育30分钟。

孵育后，倒出溶液，向检测区域加入一抗溶液，向对照区域加入抗体对照溶液，在4 °C条件下孵育过夜。

第二天，倒掉抗体溶液，用 TBS 将两个区域各清洗三次。然后加入 3% 正常山羊血清溶液，以防止非特异性结合，孵育 30 分钟。孵育结束后，加入二抗溶液，继续孵育 30 分钟。

倒掉抗体溶液，用TBS洗涤三个区域，然后进行染色显色。接下来，为进行亲和素偶联的辣根过氧化物酶反应，加入稀释的亲和素过氧化物酶溶液，孵育30分钟。将玻片置于显微镜下，放大200倍，在两个区域均加入新配制的DAB溶液。

持续观察红细胞的染色情况，并在背景开始着色之前，用一次性移液管吸除DAB溶液以终止染色。进行样本脱水时，将玻片置于玻璃架中，依次浸入浓度递增的乙醇中各5秒，最后放入二甲苯中。脱水后，将玻片放置在滤纸上，使红细胞面朝上，以吸收多余液体。

在盖玻片上加入两滴或三滴封片剂，然后用盖玻片封住载玻片。为进行观察和成像，将载玻片置于配备相机的透射光显微镜下。打开光源和相机，并启动软件。

在明场模式下，通过调节粗调和微调焦旋钮来对红细胞进行聚焦。同样地，在荧光模式下对红细胞进行聚焦。在分析红细胞灰度值时，使用ImageJ软件中的椭圆选区工具标记每个红细胞的边缘。

使用“测量”命令，测量测试样本中50个红细胞以及对照样本中10个红细胞的灰度值。对于红细胞蛋白的免疫荧光染色，将样本与荧光标记的二抗在室温下孵育30分钟，并避光。孵育结束后，倒掉抗体溶液，并用TBS缓冲液洗涤载玻片三次。

最后一次洗涤后，将 TBS 保留在样本上。对样本进行脱水处理，并加盖盖玻片制备载玻片以进行显微镜观察，操作如图所示。打开显微镜和荧光光源，在明场模式下对红细胞进行聚焦观察。

在载玻片的检测区域中随机选择至少三个不同位置，拍摄明场和荧光图像。荧光图像的曝光时间设置为1秒，拍摄一张图像。然后切换至明场模式，将曝光时间设为自动，拍摄相应的明场图像。

将图像以TIFF格式保存。在载玻片对照区域的至少两个不同且随机选择的区域中，采集荧光和明场图像。以TIFF格式保存图像，以保留像素的原始灰度值，防止压缩，并保留采集过程中的元数据。

为了测量所捕获红细胞的灰度值，打开 ImageJ。使用椭圆选区工具标记每个细胞，并通过“测量”命令进行分析。选取三到五个无红细胞的区域，测定其灰度值以评估背景信号。

为了对捕获的图像进行替代性数据分析，可通过 ImageJ 的 Fiji 发行版创建宏命令，以实现对给定图像的自动选择、背景校正和灰度值分析。在 Fiji 中打开待分析的 TIFF 格式图像，然后打开红细胞荧光图像。

点击 ijm macro，然后点击运行。通过免疫组织化学和免疫荧光法，检测了静息状态及在机械力作用下针对红细胞一氧化氮合酶（NOS）在丝氨酸1177位点发生磷酸化的抗体信号。与未受剪切力作用的红细胞相比，当使用免疫组织化学或免疫荧光方法检测时，经机械力作用后，针对在丝氨酸1177位点磷酸化的红细胞NOS的抗体信号增加了三倍。

用户需确保抗体仅应用于检测区域，否则将因缺少对照而无法分析样本。由于存在多种多样的抗体，该方法可用于靶向多种不同的蛋白质和信号通路。