红细胞上抗体诱导补体活化的定量检测方法

以下实验的总体目标是评估患者血清中针对红细胞（RBC）的抗体所介导的补体激活。该方法通过在存在阻断性抗C5抗体的条件下，将红细胞与患者血清共同孵育，从而诱导C4和C3在红细胞表面的沉积。随后，使用荧光标记的抗C4和抗C3抗体对红细胞进行染色，并可通过流式细胞术分析红细胞表面补体沉积的量，此为一种替代性检测方法。

将红细胞与患者血清在无抗C5的条件下孵育，以诱导补体介导的溶血。随后可通过分光光度法测定细胞释放的血红蛋白量，从而确定裂解红细胞的百分比。与常规诊断中使用的溶血试验或抗球蛋白试验等现有方法相比，该新技术的主要优势在于其具有定量性质，能够检测补体激活的亚优化差异。

本实验室的博士后 Elizabeth Brook 将演示以下实验步骤。首先，用 PBS 洗涤零型红细胞三次，然后按 1:2 的比例将细胞沉淀重悬于 0.5% 罗马兰溶液中，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。再将细胞洗涤三次后，用新鲜 PBS 配制成 3% 的细胞悬液，于 4 摄氏度保存。为通过流式细胞术分析红细胞上的补体沉积，首先将所需量的患者血清在 56 摄氏度下加热灭活 30 分钟。在血清加热处理的同时，用 Roal 缓冲液将经 brola 处理的红细胞洗涤三次，最后一次洗涤后即可使用。

将沉淀重悬于vbg plus plus中，稀释度为0.5%。接下来，在玻璃珠中加入25微升0.5%红细胞、37.5微升新鲜AB血清以及37.5微升浓度为200微克/毫升的抗C5，分别加入96孔圆底板的每个孔中。然后，按适当浓度将热灭活的患者血清加入各孔中，必要时用热灭活的AB血清补充，并设置阴性对照。

使用VBG plus plus将每个孔补至终体积150 µL，然后将培养板用E IA箔覆盖，在37°C下震荡孵育1.5至2小时。孵育结束后，用含0.5% BSA的PBS洗涤细胞3次，然后以每毫升1 µg的浓度标记细胞。加入荧光标记的抗C3和抗C4单克隆抗体，在室温下轻柔震荡孵育30至45分钟，孵育后再次用PBS洗涤3次，最后将红细胞重悬于每孔150 µL含0.5% BSA的PBS中。

将细胞悬液转移至新的96孔圆底板中，然后将该板放入流式细胞仪，利用前向散射图将单细胞与双联体分离开。在单个红细胞群上设门，随后选择适当的荧光信号检测通道。采用中位荧光强度进行定量溶血分析以量化结果，按照前述方法加热并活化患者血清，并洗涤经罗马生菜处理的红细胞。

随后，将红细胞与补体及患者血清孵育（操作如前所述），但不加入抗C5抗体，于664 ×g条件下以降低的减速速度离心5分钟。接着，小心吸取90微升上清液转移至新的微孔板中，注意避免转移完整的细胞并防止产生气泡，然后使用分光光度计在414至690 nm波长范围内测定吸光度。溶血程度以在纯水中孵育的红细胞样本完全裂解的百分比表示。

在本图中，展示了经brola处理的红细胞的代表性散点图，其中可见适用于单个红细胞的门控设置。通常，约95%的红细胞位于此单细胞门控范围内。在这些直方图中，展示了自身免疫性溶血性贫血（aha）作用的代表性结果。

如预期所示，患者血清中C4和C3的沉积量随血清量增加而增加。令人好奇的是，补体沉积呈现出两个明显分离的阳性峰。这种现象可能并非由红细胞群体的异质性引起，因为红细胞来自单一供体；尽管该现象的具体原因仍在研究中，但本实验通过折线图展示了各样本的中位荧光强度，以说明C4和C3沉积检测的可重复性。

注意各种AH H患者样本在沉积上的显著差异。最后，这些图表中可观察到含有针对红细胞自身抗体的ahha患者血清样本的溶血试验数据。使用该血清样本进行滴定，加入适当的补体抑制剂（如抗C5）后，可得到一条清晰且可重复的曲线。

溶血信号可以如本图所示进行滴定消除。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过流式细胞术分析C3或C4的沉积，或通过定量溶血试验来检测红细胞特异性抗体介导的补体激活。