利用zSpRY-ABE8e实现高效无PAM限制的碱基编辑以构建斑马鱼人类遗传病模型

该方案使研究人员能够构建多种此前无法获得的与疾病相关的斑马鱼单核苷酸变异模型。PAM限制是构建精确动物模型的主要障碍，而zSpRY-ABE8e能够实现高效的腺嘌呤到鸟嘌呤的碱基转换，具有较低的脱靶突变率和宽松的PAN限制。该工具可用于构建精确的斑马鱼模型，以研究与单核苷酸变异相关的致病特征和疾病机制，以及开展针对此类疾病的药物筛选。

首先，设置微电极拉制仪系统并预热至少30分钟。拉制玻璃毛细管时，选择一个程序，将斜率测试值设为加热，拉力设为50，速度设为100，时间设为50，压力设为30。接着，安装毛细管，确保其位于凹槽内。

按下“拉制启动/停止”按钮以运行程序。为保存拉制好的毛细管，将其插入带有缝隙的泡沫中，使针头保持悬空状态。实验时使用文中所述的zSpRY-ABE8e mRNA，以及两端经2'O-甲基硫代磷酸修饰的easy edit sgRNA。

在设计gRNA时，优先选择NRN作为PAM序列，因为zSpRY-ABE8e对NRN PAM的偏好性高于NYN PAM。目标腺嘌呤核苷酸应位于原间隔序列第3至第9个核苷酸之间的高活性编辑窗口内。在注射前一晚设置好交配用鱼缸。

插入隔板，将两条雌性斑马鱼和一条雄性斑马鱼放入每个水箱中。在每个水箱上加盖。次日早晨，使用无RNase的枪头、离心管和手套，将解冻的mRNA和EEgRNA在冰上混合，终浓度分别为每微升400纳克和每微升200纳克。

配置气动显微注射器时，首先关闭气泵的减压阀。然后打开主阀门，拧开气瓶，并将减压阀的压力调节至 0.2 兆帕。现在打开显微注射器，并将模式设置为定时模式。

将参数压力阀调节至20磅每平方英寸，定时器值调节至0.040秒。在体视显微镜下，使用精细镊子以倾斜角度折断拉制的玻璃毛细管针头。使用微量加样器吸头，将mRNA/gRNA混合物加入玻璃毛细管尖端，并将针头安装到显微操作器上。

使用微毛细管，设置压力和定时器参数，使每次注射产生两纳升的混合液。鱼类交配10至15分钟后，用滤网收集卵子。在体视显微镜下观察细胞阶段和卵子质量。

选择单细胞期卵子进行显微注射，以提高基因编辑效率。将卵子排列在1.5%琼脂糖注射板上，利用显微镜将2纳升RNA混合物注入胚胎细胞中。将注射后的卵子收集至培养皿中，加入E3缓冲液，并在28°C条件下孵育。

移除未受精卵，并在受精后48小时内每12小时更换一次培养缓冲液。受精后48小时，将六枚随机选取的已注射胚胎分为三组，收集至PCR管中。待六枚随机选取的对照组胚胎收集完毕后，使用移液器吸除残留的E3缓冲液。

向胚胎中加入 40 微升 50 毫摩尔的氢氧化钠。将试管置于 95 摄氏度的金属浴中孵育 20 分钟，然后涡旋 15 秒。向每个试管中加入 4 微升 pH 为 8 的 1 摩尔 Tris 盐酸盐。

在室温下以 2000g 离心 10 秒。将上清液转移至新的 PCR 管中。从 PCR 管中取出 1 µL 上清液用于 Sanger 测序。

然后将剩余的上清液保存在 20 摄氏度。为分析 Sanger 测序数据，首先将测序文件上传至“上传 ab1 文件”框中。将 20 个碱基对的 gRNA 序列以 5' 到 3' 方向输入“输入 gRNA 序列”框中。

在“5'端起始”和“3'端结束”框中输入相应的碱基位置。点击“预测编辑”并检查测序数据质量，以获得碱基编辑效率。通过将Tsr2基因起始密码子中的腺嘌呤转换为鸟嘌呤，构建了钻石-黑扇型贫血斑马鱼模型。

EditR 对序列数据的分析显示，在 Tsr2 起始密码子的腺嘌呤碱基处存在 AG 重叠。两天大的 Tsr2 胚胎表型显示，与对照组胚胎相比，眼睛更小。在突变胚胎中还观察到心包肿胀。

为了实现高效的碱基编辑，请严格遵循前述的指南设计原则，这是实验成功的基本前提。精确的模型对于单核苷酸变异相关疾病的研究至关重要。SprY-ABE8e 的开发为精准建模提供了有效工具，有助于推动疾病机制及治疗策略的研究。