采用离子阱质谱与多级碎片分析对藏药中化合物结构进行标准化鉴定
2023年3月17日
本文介绍了一种通用的实验方案与设计方法，可用于鉴定藏药中复杂天然产物制剂（基质）中的痕量成分和次要组分。
该方法可帮助研究人员分析藏药化合物的结构，尤其是植物的化学成分，为天然药物中化合物含量的定性研究提供依据。该技术的主要优势在于，所获得的化合物结构的准确性高于数据库中的数据。
该技术可用于膀胱或尿液中代谢中间产物的结构分析。首先，进行藏药秋葵子（Abelmoschus manihot）种子的样品制备：准确称取1克AMS，置于含有30毫升80%甲醇的锥形瓶中。
使用40千赫的超声波清洗仪，在25摄氏度下对混合物进行30分钟的提取。然后，在14,000g条件下离心样品5分钟。准备一支进样注射器和一个有机系0.22微米微孔滤膜，将上清液过滤至2毫升样品瓶中。
打开真空泵开关后，开启氩气瓶的主阀及分压阀，并将压力调节至约 0.3 兆帕。然后打开氮气阀。启动质谱（MS）控制软件。
在软件面板中点击加热电喷雾离子源（Heated ESI Source），设置质谱参数，包括加热器温度、气体流速、正负离子模式下的喷雾电压以及毛细管温度。点击“应用”按钮以激活用于液相色谱（LC）的离子源。分别使用含0.1%甲酸的水溶液和纯乙腈配制流动相A和B。在将溶液分别连接至A和B流路之前，于40千赫兹超声波浴中脱气至少15分钟。
配制体积比为1:9的甲醇-水溶液，然后手动将其注入泵和进样器的清洗液瓶中。启动液相色谱-质谱（LC-MS）控制软件后，点击“Direct Control”以打开液相色谱控制面板。将泵模块上的冲洗阀逆时针方向打开。
单击“更多选项”以打开泵设置，将冲洗参数设定为每分钟五毫升，持续三分钟。单击“冲洗”以开始去除气泡。完成后，关闭冲洗阀。
然后，单击“启动注射器”以冲洗注射器三个循环，“冲洗缓冲液环路”以冲洗环路一个循环，以及“外部清洗针头”以清洗针头一个循环。将样品瓶放入进样器中。单击“仪器设置”以打开方法编辑窗口，然后单击“新建”以创建新的液相色谱-质谱（LC-MS）仪器方法。
设定方法的总运行时间并设置压力限制。在方法编辑窗口中设置总流速、流速梯度、样品温度、色谱柱温度和就绪温度差。对于质谱方法，选择通用质谱（General MS）或串联质谱（MSn）实验类型。
输入采集时间、极性、质量范围、分流值编号和持续时间。单击“保存”以将这些设置配置为仪器方法。单击“序列设置”以打开序列表格，并在其中输入有关样品类型、文件、名称、路径、样品编号、仪器方法、位置和进样体积的信息。
单击“保存”以记录序列表，然后应用设置并启动质谱采集。要将质谱数据载入数据处理软件，请在资源管理器中双击原始文件。在基峰色谱图（BPI）中，通过单击并拖动鼠标来选择曲线下最大面积（AUC）。
相应的质谱图谱将在同一窗口中显示。选择一个目标离子进行下一步的 MS/MS 分析。重新打开方法编辑窗口，在 MSn 设置表中，将目标离子的 m/z 值保留一位小数，填入“母离子质量”列中。
接下来，选择碰撞模式并输入碰撞能量（CE值）。设置质谱/质谱（MS/MS）扫描范围。单击“保存”以记录质谱方法，并在序列表格中输入新的文件名。
单击“开始”按钮以启动 MS/MS 采集。采集完成后，在资源管理器中双击原始文件，将 MS/MS 原始文件载入数据处理软件。在谱图中识别出最强的碎片离子，并将其 m/z 值输入到 MSn 方法列表中。
在 MSn 设置表中，设置 MS3 参数，包括碰撞模式、CE 值和扫描范围。再次点击“保存”以记录质谱方法，并在序列表中输入新的文件名。点击“开始”以启动 MS3 采集。
如前所述，在资源管理器中双击原始文件，将 MS3 原始文件载入数据处理软件，并重复相应步骤以获得 MS4 谱图。为分析数据，双击原始文件以打开从 MS 至 MSn 的所有质谱图。手动计算母离子与其相应碎片离子之间的 m/z 差值。
然后，根据MS4结果手动绘制核心结构，并利用官能团或分子片段，结合m/z差值推导出原始结构。根据MSn中的每个分子结构，手动绘制分子裂解路径。模型碳水化合物纤维二糖的ESI-MS在正离子模式下产生质子化分子MH，其m/z为365。
产物离子扫描，即CID MS/MS，产生了一个质荷比（m/z）为305的第二个碎片离子。进一步地，MS3和MS4分析依次产生了质荷比（m/z）为254和m/z为185的第三和第四个碎片离子。MS/MS分析揭示了离子碎裂的顺序，即环打开水解、C-C键断裂和脱水反应。
因此，该方法适用于碳水化合物。采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（LC Q-TOF MS）对AMS进行初步定性分析，结果显示存在多种未知化合物。对质荷比（m/z）为617的[M-H]⁻离子进行负离子模式MSⁿ分析，产生了质荷比为571的第二个碎片离子。
对该碎片离子进行MS3分析，通过失去相当于32道尔顿的甲醇（羟乙基）和18道尔顿的水（羟基），生成了m/z为525的第三个碎片离子。MS4分析产生了m/z为344和273的第四个碎片离子。通过人工鉴定核心结构，揭示了m/z为617的化合物的分子结构及其在MSn中的裂解路径。
对另一种未知化合物的 M H 离子进行了产物离子扫描，并揭示了其分子结构和裂解机制。开启真空泵后，需等待至少五小时，以确保达到实验条件所需的足够真空度。可采用统计分析方法对具有相同或相似质荷比的碎片进行归类整理。
随着质谱分析溶液的增加，该技术可帮助研究人员在天然药物中获得新的化合物。
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概述
本文介绍了一种用于鉴定藏药制剂中痕量成分和次要成分的实验方案。重点在于分析复方结构，特别是其中来源于药材成分的结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 天然产物
- 植物化学
背景
- 藏药使用复杂的天然产物配方。
- 了解其成分可提高这些药物的疗效。
- 化合物的准确分析对质量控制至关重要。
- 本研究聚焦于黄蜀葵种子。
研究目的
- 分析藏药中化合物的结构。
- 为天然药物的定性成分提供见解。
- 提高化合物结构鉴定的准确性。
使用的方法
- 黄蜀葵种子的样品制备。
- 称取一克样品。
- 加入30毫升80%甲醇混合。
- 采用先进的分析技术进行结构分析。
主要结果
- 该方法比现有数据库具有更高的准确性。
- 获得了对化合物定性研究的深入认识。
- 在分析代谢中间产物方面具有潜在应用价值。
- 在天然药物分析中表现出有效性。
结论
- 该技术有助于加深对藏药化合物的理解。
- 它为分析复杂的天然产物提供了一种可靠的方法。
- 未来的研究可在此发现的基础上拓展更广泛的应用。
常见问题
行业应用价值
采用多级裂解的标准化离子阱质谱技术，可对藏药等复杂天然产物基质中的未知化合物进行精确的结构解析。该技术通过提供超越数据库匹配的更高置信度化合物鉴定，弥补了早期发现与靶点验证中的关键空白。该方法通过降低天然产物来源药物发现中分子表征的风险，支持研发管线的推进。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够高置信度地鉴定复杂混合物中的未知生物活性化合物。
- 通过阐明光谱数据库中未收录的化合物结构，支持机制层面的风险评估。
- 通过详细的碎片分析，促进功能靶点的验证。
- 提高天然产物先导化合物推进过程中的预测置信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选工作流程制备经过结构验证的参考化合物。
- 标准化样品制备与质谱采集，以实现可重复的检测方法开发。
- 提供定量的质谱输出结果，用于可靠的化合物比较。
- 支持在多种天然产物文库中实现可扩展性及平台重复利用。
转化与临床前研究
- 将化合物鉴定与天然产物研究中的转化生物标志物发现相结合。
- 通过解析结构模糊性，确保从早期发现到临床前验证的连续性。
- 支持基于风险评估的天然产物来源候选物推进决策。
- 提供与疾病模型相关的代谢中间产物的机制性见解。
流程与工作流整合
该标准化的多级质谱（MSn）工作流程整合了从早期发现到先导化合物鉴定的全过程，可在临床前评估之前实现对化合物的可靠表征。
- 发现生物学：通过解析未知化合物结构，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、定量的质谱输出，用于检测就绪性评估和化合物初筛。
- 分析：提供详细的碎片谱图和质荷比差异分析，支持比较研究。
- 转化研究：将化合物鉴定与生物标志物匹配及临床前模型选择相连接。
- 企业级复用：建立一种通用且标准化的方案，适用于多种天然产物来源。
运营与企业影响
- 科学价值：提高化合物鉴定的预测置信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：增强分析流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：在天然产物组合中实现更优的“推进/终止”决策和资本使用效率。
- 组合影响：支持基于结构确证的候选分子进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 进行 MSn 分析需要具备质谱技术专业知识以及手动解析数据的能力。
- 需要使用先进的液相色谱-质谱（LC-MS）仪器及数据处理软件。
- 需要在不同团队之间对样品制备和质谱采集方案进行标准化。
- 针对不同化合物类别或天然产物基质，可能需要进行方法调整。
- 手动分析步骤可能限制通量，并需要专门培训。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Abelmoschus manihot Seeds (AMS) Sample Preparation
1:32
Mass Spectrometry (MS) Setting
2:12
Liquid Chromatography Prerun, Method Establishment, and MS Acquisition
4:07
Operating Multiple-Stage Mass Spectrometry
6:10
Manual MSn Data Analysis
6:47
Results: Multiple-Stage Fragmentation and Structural Analysis of Unknown AMS Compounds
8:37
Conclusion
