使用参考试剂验证细胞因子释放检测的稳健性以预测单克隆抗体安全性

新药的安全性测试至关重要，本方案描述了如何使用经过验证的标准来评估CRS平台的可重复性、稳健性以及潜在局限性。该技术已在11个不同的实验室中使用这些试剂进行了验证，并通过一项国际协作研究证实了其反应模式的一致性，从而促进了标准化和可重复性方面的改进。该技术的应用可进一步提升对新型治疗性抗体的CRS风险测试水平，同时也有助于为潜在不良反应的临床管理做好准备。

本工作的目的是提高实验的可重复性和标准化水平，而可视化演示有助于提升可重复性。首先，将参考试剂安瓿中的内容物用一毫升无菌蒸馏水重新溶解，并静置5至10分钟以充分水化。随后，在将每种抗体溶液转移至无菌带盖试管前，应将其充分混匀。

接下来，用无菌 PBS 将每种复溶后的抗体和待测抗体稀释至每毫升含 10 微克。取一个无菌、未经组织培养处理的 U 型底聚丙烯 96 孔微孔板，向板中指定孔加入 100 微升所需浓度的稀释抗体溶液。然后，在进行固相检测前，于 4 摄氏度下孵育过夜。

采集至少30毫升外周全血至含肝素的试管后，轻轻颠倒混匀数次，以确保血液样本与肝素钠充分混合。另取一支试管留取15毫升全血样本，用于后续的水相全血检测。将剩余的15毫升全血加入等体积的PBS或无血清RPMI 1640培养基进行稀释。

将稀释后的血液轻柔地加至50毫升离心管中密度梯度液的上层，密度梯度液体积为15毫升。使用水平转子离心机，以500 ×g、室温、无刹车及低加速条件离心20分钟，以分离血液的不同组分。离心后，密度梯度液将分为数层：上层为血浆，中间为含有外周血单个核细胞（PBMCs）的薄层——即棕黄层（buffy coat），下层则含有红细胞（RBCs）以及多形核粒细胞（包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞）。

小心移除上层血浆层，随后去除下一层，以收集外周血单个核细胞（PBMCs）。洗涤时，将收集的血沉棕黄层重悬于10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）或无血清RPMI 1640培养基中。将离心管以500 ×g离心10分钟，使细胞沉淀。

弃去上清液，再次重复洗涤步骤。然后，将所得沉淀重悬于2 mL完全RPMI培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并用完全RPMI培养基调整PBMC浓度至每毫升100万个细胞。

对于水相全血细胞因子释放检测，取先前留出的全血样本，将190微升样本加入96孔U型底聚苯乙烯板的孔中，将经热处理的抗体和参考试剂用PBS预稀释至100微克/毫升，然后向含有190微升全血的指定孔中加入10微升所需稀释浓度的抗体。将板在37°C、湿润的培养箱中孵育48小时。对于固相PBMC细胞因子释放检测，取先前制备的包被板。

使用多通道移液器，弃去包被板中的抗体溶液。用 PBS 填充试剂储液槽后，每孔加入 200 µL PBS 洗涤三次，以去除未结合的单克隆抗体。向每个孔中加入 200 µL 前述制备好的外周血单个核细胞（PBMC）悬液。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育48小时。在分别加入对照和待测单克隆抗体孵育48小时后，以400 ×g离心5分钟。收集细胞条件培养基或血浆，注意勿扰动细胞沉淀。

将收集的上清液或血浆在-20摄氏度下冷冻保存。PBMC固相检测结果显示，与同型匹配的对照抗体相比，阳性对照抗体诱导产生了显著高水平的细胞因子。同时观察到，抗-CD28超级激动剂抗体相较于其同型对照，诱导白细胞介素-2（IL-2）释放的倍数变化显著更高；而抗-CD3和抗-CD52抗体虽然也能诱导IL-2表达，但其倍数变化较低。

在全血水相检测中，可检测到的细胞因子水平较固相检测相对较低，但其对抗CD52刺激的敏感性更高。