微流控方法解析单个多功能细胞同时与顺序性细胞因子分泌

在本项目中，我们致力于开发并应用新型分析策略，以实现对单细胞分辨率下细胞功能的直接、定量和深度分析。通过超越单纯的单数据点测量，我们旨在更深入地理解并利用源自宿主和组织中复杂响应的多功能性。要全面理解这些功能十分复杂且具有挑战性，需要采用跨学科的方法。

因此，这一背景下的一个挑战是确保所开发检测方法的动态范围能够适当地捕捉分泌蛋白的含量及其动态变化，而这些蛋白在不同样本、制备方法和组织之间可能存在巨大差异。免疫反应调控的紊乱可引发多种疾病，导致从轻微发热到可能危及生命的严重并发症。在传统终点检测的基础上，我们提出在单细胞水平上直接动态测量免疫细胞的失调与活化状态，以获得更深入的见解。

因此，细胞因子通常在特定时间点检测，以培养上清液中的浓度或活化细胞的百分比来表示。传统的批量检测方法用于量化每个细胞的分泌情况，但这种终点测量法会掩盖细胞间的异质性，无法区分同时分泌与继发性分泌，从而忽略了免疫应答的动态特性。细胞多能性是指免疫细胞同时分泌多种细胞因子的能力。

这使得它们能够精细调节对威胁的应答，例如，动态地（即随时间变化）测量这种多功能性，可深入了解免疫应答的不同细微特征。首先，将带孔的玻片放置在清洁的表面上，等离子活化面朝上。沿切割方向小心地从双面胶带的一侧移除保护层。

将胶带与载玻片的边缘及钻孔对齐。从载玻片的短边开始粘贴胶带，并确保其良好粘附。移除胶带的第二层保护膜后，将第二张载玻片的活化表面朝下放置。

使用一块平板，利用上半身力量将两张载玻片压合在一起，持续10秒。翻转腔室，使孔洞朝向操作者。在纳米进样口下方的环形区域滴加少量紫外光固化胶。

使用微管将纳米端口沿玻片上的孔滑入，并在端口周围涂上一圈紫外光固化胶。将1毫升用氟化油配制的1%溶液吸入注射器中。通过连接在聚四氟乙烯微管上的聚四氟乙烯注射器滤膜和针头，将溶液注入观察室。

孵育1分钟后，在通风橱内使用氮气压力将包被溶液冲洗出来。使用另一套注射器组件，仅用氟化油冲洗腔室。首先，向用于TNF-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6检测的试管中加入链霉亲和素功能化的纳米颗粒。

将链霉亲和素与纳米颗粒用等体积的磷酸盐缓冲液稀释。然后将生物素化捕获抗体溶液加入各管中，在室温下孵育30分钟。接着，向每管中加入0.01%的1毫摩尔D-生物素溶液，孵育5分钟。

然后将一块钕磁铁靠近离心管以收集颗粒。弃去上清液，并立即用Pluronic F-127与PBS的混合液重新悬浮纳米颗粒，孵育30分钟。在储存缓冲液中孵育颗粒30分钟后，搅拌以确保形成均匀的混合物。

在包封前立即混合白细胞介素6、TNF-α和白细胞介素1β的偶联纳米颗粒。随后，如前所述使用磁铁用完全培养基洗涤颗粒，并将磁珠重悬于完全培养基中。之后，加入针对白细胞介素6、TNF-α和白细胞介素1β的检测抗体，使其终浓度达到10纳摩尔。

首先，用1毫升注射器吸取500微升的连续相。将PTFE微管连接至27号0.75英寸针头上。将该组件安装到注射器上，再将注射器安装到注射泵上。

然后，使用0.75毫米的活检打孔器在PDMS切片的中央打一个孔。将约三厘米长的PTFE管从切片的孔中穿过，并将该组件推入200微升移液枪头的顶端。在移液枪头上方用紫外光固化胶密封连接处，并将管的另一端连接至23号1.25英寸的针头。

接下来，用两个1 mL注射器各吸取500 µL轻质矿物油。使用定制的连接装置将两根23号针头连接到注射器上，并将其安装到注射泵上。通过注射泵控制软件，将功能化纳米颗粒与细胞溶液吸入水相的移液管尖端中。

清洗制备好的观察室后，将其夹入装有两个钕磁铁且角度为30度的打印腔体支架中。打开两个端口，并在上端口塞入一张纸巾，以吸收填充过程中多余的外相液体。将连续相连接到微流控芯片的顶部入口。

然后，以每小时1800微升的流速，用连续相冲洗芯片约30秒。将水相溶液的移液枪头连接至芯片的两个中间入口。以每种溶液每小时200微升的流速开始水相溶液的流动。

当液体在出口处出现后，以每小时800微升的流速开始注入氟化油相。等待直至液滴生成趋于稳定，此时出口处将呈现均匀的灰白色有光泽溶液。随后，将PTFE微管连接至出口端口以收集液滴。

使用指旋一体式接头的卡套模块，将流体直接导入观察室。待观察室充满后，停止流动，并用指旋压力将端口堵头拧紧以封闭端口。液滴生成后，先用氟化油冲洗芯片，再通入氮气以吹出任何残留液体。

将腔室支架安装在带有孔板格式载物台的显微镜上。然后使用10倍物镜，将显微镜切换至明场通道。在明场下对固定化的液滴进行调焦，并将其移至腔室中央。

然后，启动自动对焦系统。调整明场通道的测量平面，使液滴边缘呈现为清晰的黑色圆圈，能够与油相及背景明显区分。依次检查各个荧光通道，并为每个通道设置最佳的测量平面。

进行位移测量时，需在 FITC、TRITC 和氰五（cyanine five）通道中观察纳米颗粒聚集体。