基于光学系统的水凝胶包埋完整小鼠肌纤维高通量收缩力测量

本方案可用于评估基因突变对肌纤维功能的影响，此外还可用于旨在改善肌肉健康的药物筛选研究。该技术可在相对较短的时间内分离并测量大量肌纤维的收缩功能，且无需高级培训。

可以通过改变水凝胶的组成，以验证环境信号对健康和病变肌肉的影响。该实验步骤中最困难的部分是肌肉的初始解剖。如果操作不够谨慎，可能会造成肌肉损伤，从而导致肌纤维活力下降。

本实验操作将由本实验室的研究技术员 Leander Vonk 和博士生 Osman Esen 演示。首先，在已处死小鼠的踝关节上方切断其后肢下部。然后，从足背侧向脚趾方向在皮肤上做一切口。

小心地向脚趾方向剥离皮肤，注意不要损伤肌肉。将解剖好的足部置于含有10毫升预热至37摄氏度的解剖液的密封培养皿中。通过仍附着在脚趾上的皮肤将足部固定。

在踝关节远端固定小腿，仔细剥离肌肉表面的结缔组织。在足跟处切断肌腱并抬起肌肉。沿肌肉侧面及下方切开结缔组织，直至暴露脚趾的肌腱。

当三条肌腱有一半长度暴露时，切断肌腱。将肌肉从足部分离，并固定趾短屈肌（FDB）的肌腱。清除肌肉上残留的任何结缔组织。

将洁净的肌肉组织转移至含有预热解离液的离心管中。使用血清移液管将短收肌转移至含有肌肉消化液的离心管中。将组织置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育80分钟。

将肌肉转移至含有3毫升解离培养基的15毫升离心管中。使用预先准备好的吹打枪头，从最大号到最小号依次吹打肌肉，持续吹打直至肌纤维从肌腱上分离。可用P200枪头移除肌腱。

将解离的肌纤维转移至含有10毫升解离培养基的15毫升离心管中。在培养箱中孵育20分钟，使纤维沉降形成沉淀。小心地用移液器吸除纤维沉淀上方的所有培养基。

在冰上，将每份肌肉的细胞用 875 微升细胞混合液重悬。向含有 125 微升细胞悬液等分试样的离心管中加入 125 微升基质细胞混合液。轻轻吹打混匀，避免产生气泡。

立即将最终混合物转移至孔板中。在显微镜下检查肌纤维的活力。将凝胶置于培养箱中孵育30至45分钟，以促进凝固。

操作完成后，小心向每个孔中加入 500 µL 培养基。打开基于光学的收缩力测量系统、荧光灯、细胞电刺激器和计算机。将电刺激器设置为 1.0 Hz、10 伏特，脉冲持续时间为 5 毫秒，以刺激分离的肌纤维。

将培养板插入测量系统中。将起搏器连接到插入物上，并将其插入培养板中。打开 IonWizard 程序。

单击“确定”。点击“文件”图标，然后选择“新建”以打开一个新文件。选择“采集实验”以检查程序是否处于正确的实验骨骼肌节上。如需更改实验，点击目标实验，然后按“添加”。

设置参数为 SARC 20X，平均扫描线，单次 FFT，采样率为 250 赫兹，采集时间为 10 秒。将测量系统温度调整至 25 摄氏度。点击打开细胞查找器，弹出新窗口。

选择培养板类型和活性孔。通过调节焦距滑块使纤维聚焦。启动 pacing 以施加电刺激，并观察纤维的收缩情况。

保持肌节处于焦点位置，确保测量区域固定在纤维末端，使肌节呈垂直方向排列。当肌节聚焦清晰时，工具栏中将显示一个单一峰，该峰会随着收缩向右移动。在测量系统上对纤维进行测量。

单击“开始”以启动实验。按下 Q 键开始测量 10 次收缩瞬变。如果有超过四次瞬变看起来无噪声，则按下 Z 键确认测量结果。

如果瞬时信号噪声过大，则舍弃该次测量。实验结束后，按“停止”以关闭细胞查找窗口。保存文件并创建新文件。

打开程序 CytoSolver 桌面版，然后点击“导入”并选择要分析的文件。分析完成后，识别蓝色、红色和灰色峰。点击“导出”。

选择标题为“平均值到瞬态数据”的框，并导出至 Excel。由于三维纤维蛋白水凝胶可防止侧向移动及其他影响因素，因此在该条件下获得了更高比例的可用收缩性肌肉测量数据。纤维包埋对最大收缩速度或肌节缩短程度均无显著影响。

在纯基底膜基质中观察到收缩减弱，这可能是由于凝胶硬度增加或细胞与基质相互作用增强所致。类似地，与纤维蛋白水凝胶相比，基底膜包埋也减少了肌节的缩短。需要注意的是，分离的肌纤维非常脆弱，在移液过程中应格外小心，避免对其造成损伤。

分离完成后，还可进行免疫染色、蛋白质和RNA提取等方法。该技术的发展为以高通量方式研究成熟肌纤维功能开辟了新的可能性。