光遗传学调控心肌细胞活性的机电评估

通过该方案，可测试不同光遗传学效应器对心肌细胞活动的生物物理效应，从而推动光遗传学实验在心脏组织及完整心脏中的发展。结合膜片钳技术、肌节追踪以及碳纤维辅助的力学测量方法，我们能够研究GtACR1光激活对心室心肌细胞电活动和机械特性的影响。光遗传学抑制技术有望应用于光学除颤。

GtACR1 是一种光遗传学工具，可实现对心脏活动的抑制。该技术完全适用于其他研究领域，如平滑肌和单细胞肌细胞研究。尽管本方案不适用于高通量筛选，但它为心肌细胞电生理功能和机械功能的全面分析提供了有效手段。

常言道，一图胜千言。那么一段视频又能传递多少信息呢？我们所采用的一些工具和单细胞拉伸技术以及探针制备方法极为精细复杂，通过视频来展示远比文字描述更加直观易懂。

从一只9至10周龄的新西兰白兔的盐水灌注心脏中将血液冲洗干净后，将灌注液更换为低钙、高钾溶液，并在心脏停止跳动后再继续灌注两分钟。灌注酶溶液，在消化开始两分钟后将酶溶液重新循环回储液器，并在消化五分钟后将流速降至每分钟16毫升。当组织在消化40至50分钟后变得柔软时，立即将心脏从灌流插管上剪下，并立即放入阻断液中。

加入封闭液直至完全覆盖组织。剪除右心室和室间隔，分离出左心室。去除乳头肌，使用精细镊子和移液器轻轻撕解组织，通过机械解离释放细胞。

将细胞悬液通过孔径为1平方毫米的滤网过滤，并通过离心沉淀细胞。然后将心肌细胞沉淀重悬于新鲜的封闭溶液中。进行膜片钳实验时，在细胞培养前立即用每毫升100微克的层粘连蛋白包被已高压灭菌的盖玻片。

进行碳纤维实验时，使用95%乙醇与5%水的溶液配制浓度为0.12克/毫升的Poly-HEMA，并将其涂覆于培养皿表面。心肌细胞重悬后10至15分钟，吸除上清液，并将细胞重新悬浮于培养基中。计数后，将细胞以每毫升1.75 × 10⁴个细胞的目标密度接种至培养皿中的盖玻片上。

将培养物在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育3至4小时。孵育结束后，将盖玻片培养物中的培养基更换为含有腺病毒5型的新鲜培养基，该病毒编码GtACR1-eGFP，感染复数为75。将培养物放回孵箱继续培养48小时。

进行膜片钳实验时，使用微电极拉制仪从钠钙玻璃毛细管中拉制1.7至2.5兆欧的膜片电极，并启动数据采集软件。将带有细胞的盖玻片放入盛有外部溶液的记录室中，根据细胞的eGFP荧光选择心肌细胞。接着，用内部溶液填充膜片电极，并将电极安装至电极夹持器上，同时将涂有氯化银的银制记录电极插入内部溶液中。

设置膜测试，以0毫伏为基线，施加10毫伏、持续15毫秒的脉冲。达到细胞贴附构型后，在数据采集软件中切换至全细胞模式，钳制电位为-60毫伏。随后轻轻施加负压，击穿膜以进入全细胞构型。

成功的破裂将表现为所测电容立即增加。在电压钳制模式下，于负74毫伏记录光激活程序，使用持续300毫秒的光脉冲；或在电流钳制模式下，于零皮安记录动作电位。为制备碳纤维，首先将移液管安装到拉制仪的移液管支架上。

将玻璃毛细管拉制成两根移液管，总锥形长度约为11毫米，末端内径约为30微米。接着，使用体视显微镜将一根毛细管对准定位圈，并用弯曲器向下按压毛细管尖端，将其弯曲至最多45度。加热灯丝，直至毛细管在移除弯曲器后仍能保持45度弯曲角度。

弯曲毛细管后，使用带有软管的精细镊子从管中取出一根碳纤维，并将其插入毛细管的细端。将碳纤维推入毛细管，直至到达弯曲处。剪断碳纤维，使其从毛细管尖端伸出2 mL，并用氰基丙烯酸酯胶水将纤维固定在每根毛细管的前端部分。

为校准光纤，将一根毛细管连接至由显微操作器和压电马达控制的固定装置上。将毛细管向传感器方向移动，并相对于传感器进行对准。将光纤尖端与力传感器接触，但不产生任何作用力。

压电马达的总移动距离为 60 微米。将压电马达以六个 10 微米的步进向力传感器移动。该传感器的灵敏度为 0.05 毫牛顿每伏，力的测量范围为 0 至 0.5 毫牛顿。

读取每一步的测量电压，并将碳纤维从传感器上移除。为了记录心肌细胞收缩时的力，用Poly-HEMA包被盖玻片表面，并将其放入测量室中。向测量室中加入外部灌流液。

将两根载有碳纤维的毛细管固定到载物台显微操作器上，并调整角度，使碳纤维接近与测量室表面水平。为检查纤维是否正确对齐，需聚焦于测量室表面，降低第一根纤维，并水平移动该纤维。纤维尖端应沿测量室表面滑动。

对第二根光纤采用相同的步骤。关闭光源后，向腔室中加入几滴培养的细胞悬液，并施加短暂的绿色光脉冲，以筛选出能够响应绿光刺激而发生收缩的细胞。连接第一根光纤时，通过缓慢降低光纤轻柔地压紧细胞，然后释放压力。

将第二根纤维与心肌细胞另一端的第一根纤维平行固定，以确保两根纤维之间包含尽可能多的肌节。当两根纤维均固定后，抬起纤维，使细胞不再与腔室表面接触。调节至肌节清晰对焦，将肌节长度追踪窗口设定在两根纤维之间，并使用边缘检测模块追踪纤维的弯曲情况。

使用红色和绿色窗口设置检测区域，并在光强度轨迹的一阶导数处定义阈值。在追踪肌节长度和纤维弯曲的同时，进行光学起搏。本实验中，我们以 0.25 赫兹的频率进行起搏。

记录至少15次光诱导收缩后，对细胞进行电场刺激。找到引发收缩的阈值，并以阈值电压的1.5倍进行电起搏。对于抑制实验方案，先施加电刺激以诱导收缩，然后在不同光强度下对细胞施加持续的光脉冲。

在光抑制后记录至少15次收缩。GtACR1在培养的兔心肌细胞中表达。在光强为每平方毫米4毫瓦、持续300毫秒的光照下激活GtACR1，在-74毫伏时产生显著的内向电流，测得峰值电流为245皮安。

在此代表性实验中，动作电位通过电流注射（强度为阈值的1.5倍）或10毫秒光脉冲分别进行电刺激或光刺激触发。光刺激起搏的心肌细胞表现出较慢的动作电位起始。在持续光照下，电刺激触发的动作电位受到抑制。

在持续光照期间，即使施加更高的电流刺激或达到阈值1.5倍的刺激强度，也不会引发动作电位。心肌细胞在电起搏时产生的收缩力为232微牛顿每平方毫米，而在光起搏后收缩力为261微牛顿每平方毫米。延长的绿色光脉冲可抑制收缩，抑制后重新出现的收缩所产生的收缩力较低，这与兔心肌细胞舒张期钙离子流失的现象一致。

我们建议在开展实验前先练习相关技术，尤其是在黑暗环境中定位微电极可能具有挑战性。分析心肌细胞收缩功能时，这一点极为重要，因为它可能影响力量的产生和舒张过程。此外，还可施加不同的后负荷，用于等张和辅助张力收缩分析。

这些技术可用于表征在心肌细胞中激活新开发的光遗传学效应器所产生的生物物理效应，这对于为每个实验选择最合适的光遗传学工具至关重要。请注意，腺病毒转导以及转导后的所有操作步骤均须在生物安全二级条件下进行。