制备包载狂犬病抗原的脉动型聚合物微粒

该方法的意义在于，它可通过单次注射实现多剂量疫苗的递送，有望挽救数百万人的生命，特别是在中低收入国家，由于获取疫苗存在困难，许多新生儿未能获得免疫接种。这种制备方法可使狂犬病疫苗在微粒中保持其原有的诱导免疫活性形态，且微粒的释放模式可模拟目前的疫苗接种程序，仅需单次注射即可完成。狂犬病是一种致命性疾病，在某些情况下需要多达五次重复接种疫苗才能防止死亡。

然而，在一次就诊中完成全部疫苗接种程序可以提高依从性并挽救生命。该技术代表了一种平台型技术，能够递送针对多种疾病的多样化治疗或预防药物。首先，将3D打印的母模表面进行处理：将其置于真空腔室内，腔室内放置一个玻璃载片，载片表面含有40微升三氯硅烷。

启动真空泵，持续抽真空一小时。将PDMS预聚物基础剂与固化剂按9:1的质量比混合于塑料杯中。然后将混合溶液转移至50毫升离心管中，在室温下以300 ×g离心3分钟。

离心后，确保溶液澄清。表面处理完成后，将主模具放入铝箔皿中，将未固化的PDMS倒入模具上，确保所有结构完全浸没。将铝箔皿放入真空腔室，抽真空一小时，以去除所有气泡。

取下铝箔皿后，在母模两端各放置一个800微米的间隔片，并将一块洁净的载玻片覆盖在母模上，避免产生气泡。使用长尾夹通过800微米间隔片将模具夹紧。将预聚物置于120摄氏度烘箱中固化4小时。

固化后，小心松开回形夹。使用刀片将母模从固化的PDMS模具上分离。制备PLGA薄膜时，将450毫克PLGA置于非粘性聚合物片上的环形垫片内。

然后，在PLGA上覆盖第二片防粘连聚合物膜，并使用一个101.6毫米的C型夹将整个叠层夹在两块铝块之间，拧紧至手指力度。将装有C型夹的组件放入真空烘箱中。在烘箱中放置30分钟后，再次拧紧夹子，并重新放回烘箱中继续处理30分钟。

然后，将组装件转移至干燥器中冷却四小时。冷却后，松开夹具，将PLGA薄膜从防粘聚合物片上取下，并放入已标记的培养皿中。将培养皿存放在干燥器内，以备后续使用。

为了制备PLGA微粒，按照先前所述方法处理PDMS模具表面。使用镊子或手术刀将250微米厚的PLGA薄膜切割成与微粒阵列大致相同的尺寸，并将其放置在经处理的PDMS模具上。在PDMS模具上的PLGA薄膜上方覆盖一片洁净的玻璃显微镜载玻片，并用弹簧夹夹住阵列和PLGA薄膜，将两者固定在一起。

将夹紧的模具组件置于真空烘箱中保持一小时，然后在室温下冷却15分钟。冷却后，用剃刀刀片轻轻施加压力，使PDMS模具与PLGA微粒阵列分离，并将PLGA微粒存放在干燥器中以备后续使用。为向微粒中填充高浓度狂犬病疫苗抗原，需先准备压电分配装置，并将载有PLGA微粒的载玻片放入分配区域。

将浓缩的抗原加入到孔板中，然后输入目标设置参数并点击“运行”。压电机器人将随之填充微粒。完成后，使用体视显微镜确认微粒是否已填充。

为密封填充的微粒，将一个不锈钢块放在加热板上，并在不锈钢块上放置两片平行的显微镜载玻片。待不锈钢块水平后，开启加热板并将温度设定为205摄氏度。当不锈钢表面达到目标温度时，将填充的PLGA微粒悬置于两片玻璃载玻片之间，并立即启动计时器，持续18秒。

将密封的微粒阵列从加热板上取下后，将其悬置于实验台上的两片载玻片上，冷却一分钟。为收集密封的微粒，将手术刀片以45度角抵住载玻片，并对微粒底部施加压力，使其从载玻片上分离。使用手术刀将收集的微粒转移至一个0.5毫升低蛋白结合离心管中。

加入 250 微升含有牛血清白蛋白和葡萄糖的 PBS，以维持狂犬病疫苗的稳定性。将样品置于体视显微镜下，使用精细镊子的一个尖端压碎颗粒。在颗粒填充过程中，需要足够的干燥时间以确保溶剂或水完全蒸发。干燥后，溶质储库会残留在颗粒核心的底部。

对于这种PLGA，理想的微粒形态出现在顶盖时间18至24秒之间，因为在此时间段内，载有货物的微粒已完全封闭，且未丧失微粒结构。当微粒被适当填充和密封后，其尺寸足够小，可轻松通过19号针头。此外，在注射至黏性溶液（如2%羧甲基纤维素）时，10个微粒能够持续稳定地通过19号针头。

透射电子显微镜图像显示，在浓缩的抗原样品中存在完整的狂犬病病毒变异株，其浓度约为起始储备液的4.4倍。封口后，约69%的抗原仍以生物活性形式被包封，表明热应力在封口过程中导致了显著的抗原损失，但大部分病毒抗原仍保持完整。微粒填充是最关键的步骤之一。

如果颗粒填充不正确，则颗粒很可能无法正确密封。为了理解其稳定性，需要进行额外的配方开发，包括在颗粒核心中加入辅料和其他生物学相关材料。