用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征
2021年8月13日
本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外 还描述了必要的表征方法，并增加了关于免疫接种的概念验证。
本方案具有重要意义，因为它展示了一种通过一步法简便制备包载核酸的聚合物纳米颗粒的方法。该技术的主要优势在于其多功能性，可适用于不同的核酸类型和细胞类型。此外，纳米颗粒的制备过程操作简单，例如通过反复吹打混匀即可完成，且可通过冷冻干燥延长纳米颗粒的稳定性和耐受储存条件。
本实验操作将由 Laura Olmo、Coral Garcia-Fernandez、Maria Stampa Lopez-Pinto、Maria Navalon-Lopez（本实验室博士生）以及 Marta Diaz-Caballero（本实验室博士后）进行演示。为形成多聚复合物（polyplexes），请解冻预先配制好的聚合物 C6 肽和聚β-氨基酯（poly beta amino esters），并涡旋振荡溶液。用移液器将聚合物溶液上下吹打混匀后，用醋酸钠配制 12.5 毫摩尔（millimolar）的溶液。
涡旋溶液并静置10分钟。接下来，将mRNA配制为0.5毫克/毫升的浓度，并用移液器混匀。再次涡旋聚合物溶液，然后在微量离心管中按1:1的比例将遗传物质溶液加入聚合物溶液中，于Thermoblock中25°C孵育30分钟。
孵育后，通过将样品加入含有1至2倍体积无RNase水的微量离心管中沉淀混合物；随后为加入辅料，向mRNA与聚β-氨基酯混合物中加入等体积的20毫摩尔组缓冲液和4%蔗糖溶液，并用移液器吹打混匀。冻干时，先将多聚复合物溶液在-80°C下冷冻1小时，然后进行一次干燥，完成后立即于-20°C保存多聚复合物，以避免重新水合。对于多聚复合物的重悬，从-20°C冰箱中取出冻干的纳米颗粒，并迅速加入相应体积的超纯水，以重新分散固体并达到所需浓度。
轻轻吹打直至完全重悬，溶解后剧烈吹打混匀，避免产生气泡。转染24小时后，将含有转染Hela细胞的96孔板置于显微镜下，使用10倍物镜开始通过荧光显微镜进行定性评估。首先进行白平衡校正，为软件创建背景参考，然后采集图像，以便在分析过程中与荧光图像叠加。
将显微镜模式切换至反射模式，并将滤光轮移至蓝色激光以观察 EGFP。然后使用相同的曝光时间获取所有条件或孔的图像。为进行流式细胞术的定量评估，用每孔 100 微升 PBS 洗涤在 96 孔板中转染的 Hela 细胞。
每孔加入25微升胰蛋白酶后吸去PBS，在37摄氏度下孵育5分钟。待细胞脱落之后，加入先前回收的培养基以中和胰蛋白酶活性，然后每孔加入31.25微升10%福尔马林固定细胞，并孵育20分钟。接下来打开流式细胞仪及其配套软件，设置实验所需的适当条件，包括样品板类型、样品体积以及其他参数，如样品间的振荡和冲洗。
通过前向散射光与侧向散射光的流式数据，首先观察以区分细胞与碎片，设置适当的参数以定量转染阳性细胞的百分比。然后绘制另一幅散点图，比较脉冲幅度与脉冲高度，以圈选并区分单个细胞。转染前一天，在96孔板中每孔接种10,000个JAWS II细胞，进行过夜培养。
第二天，每孔转染0.6微克mRNA，并在37摄氏度、5%二氧化碳的干燥空气培养箱中孵育24小时。次日，用25微升PBS洗涤孔中残留的细胞。吸除PBS后，加入25微升胰蛋白酶，于37摄氏度孵育5分钟，使细胞脱落。
通过将先前回收的培养基加入对应的孔中来终止胰蛋白酶反应。然后离心培养板，吸除培养基，并通过每孔加入50微升PBS和2.5%甲醛固定细胞，随后将培养板在4摄氏度下孵育20分钟，再次离心培养板。然后每孔加入50微升PBS和3% BSA，在4摄氏度下孵育30分钟。
孵育后再次离心培养板，然后加入50 µL含PBS和3% BSA的小鼠卵清蛋白抗体，于4 °C孵育30分钟。重复离心步骤，随后用50 µL PBS洗涤细胞。吸除PBS后，加入二抗并于4 °C孵育1小时。
孵育后，重复离心和洗涤步骤。然后将细胞重悬于100 µL PBS和2.5%甲醛中，用于流式细胞术分析。对新制备和冻干的包载GFP mRNA的纳米颗粒进行理化表征，结果显示其粒径和多分散指数无显著差异。
多聚复合物的透射电子显微镜结果显示，形成了直径约为50纳米的球形且单分散的纳米颗粒。包裹GFP或卵清蛋白的乐高肽及修饰型聚β-氨基酯多聚复合物的包封效率数据表明，不同类型的mRNA之间无显著差异。此处展示了JAWS II细胞系在转染后24小时EGFP表达的定性分析结果。
与阴性对照组进行定量比较，GFP阳性细胞百分比显著升高，且与使用经典转染试剂进行的阳性对照相当。载有卵清蛋白mRNA的寡肽及修饰型聚β-氨基酯纳米颗粒可激活树突状细胞，表现为转染细胞中CD11b和CD86膜标志物的表达水平显著高于未转染细胞。
我们的疫苗平台以mRNA作为活性成分，并结合专有聚合物，可适用于预防性疫苗以及癌症治疗。我们能够利用该技术突出其在癌症免疫治疗领域的贡献，因为我们可以将肿瘤相关抗原包裹于纳米颗粒中，从而推动癌症治疗的变革。
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概述
本文介绍了一种使用聚（β-氨基酯）聚合物制备mRNA纳米颗粒的实验方案。该方法具有良好的通用性，可实现不同核酸的包封，且侧重于简单的制备技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米颗粒合成
- mRNA 递送系统
- 聚合物材料
背景
- 聚合物纳米颗粒可包封核酸。
- 通过改变包封的mRNA，该技术易于进行修饰。
- 简单的操作流程提高了研究人员的可及性。
- 冻干可延长纳米颗粒的稳定性。
研究目的
- 展示一种制备聚合物纳米颗粒的简便方法。
- 证明该技术在不同核酸和细胞类型中的广泛适用性。
- 为免疫应用提供概念验证。
使用的方法
- 聚（β-氨基酯）聚合物的制备。
- 将mRNA包封到纳米颗粒中。
- 纳米颗粒的体外表征。
- 由实验室研究人员演示实验操作流程。
主要结果
- 该方案可有效形成多聚复合物。
- 仅需简单的移液技术即可完成颗粒制备。
- 通过冷冻干燥证明了纳米颗粒的稳定性。
- 实现了核酸的一步法成功包封。
结论
- 该方法简化了mRNA纳米颗粒的制备过程。
- 它提供了一种适用于多种核酸的通用性方法。
- 研究结果支持进一步探索免疫策略的研究。
常见问题
行业应用价值
本方案可实现mRNA负载型聚合物纳米颗粒的快速制备，用于疫苗开发，解决了裸mRNA不稳定且易被快速清除的问题。聚（β-氨基酯）类聚合物具有良好的适应性，可包载多种核酸分子，适用于预防性和治疗性应用。通过冻干处理可提高储存稳定性，降低运输成本，并支持在肿瘤学和传染病领域的规模化生产。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过递送编码肿瘤相关抗原或免疫调节蛋白的 mRNA，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过高效转染树突状细胞支持功能靶点的验证，表现为 CD11b 和 CD86 标志物的上调。
- 预测价值：通过流式细胞术提供定量转染数据，用于评估抗原表达和免疫激活情况，为继续或终止研究提供决策依据。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过理化表征和透射电镜确认，生成具有稳定粒径（约50 nm）和均一多分散性的可重复纳米颗粒制剂。
- 操作价值：仅需简单的移液和涡旋步骤，即可实现高通量制备，并可通过冻干法实现长期储存。
- 检测适用性：制备的mRNA负载型纳米颗粒可有效转染HEK293和JAWS II细胞，支持标准化免疫检测方法的开发。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过实现可激活树突状细胞的mRNA递送，将基础发现与临床前研究相衔接，这是癌症免疫治疗和疫苗有效性的关键步骤。
- 疾病相关性系统：证明了该技术适用于卵清蛋白mRNA这一模型抗原，支持其进一步拓展至肿瘤相关抗原，用于癌症疫苗研发。
- 风险控制：冻干纳米颗粒在粒径和多分散系数（PDI）上无显著变化，可确保批次间一致性，降低因制剂问题导致的失败风险。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期发现到临床前研究的连续阶段，可在先导化合物优化之前，用于基于mRNA的抗原递送以开展免疫激活研究。
- 发现生物学：通过递送编码抗原或细胞因子的mRNA，在体外评估免疫细胞的活化，从而促进假设验证。
- 筛选：提供可标准化且可冻干的纳米颗粒，实现不同细胞类型的可重复转染，支持检测方法的可扩展性。
- 分析：提供流式细胞术读数，包括GFP+细胞百分比及标志物表达（CD11b、CD86），实现对制剂效能的定量比较。
- 转化研究：支持从体外树突状细胞活化到临床前免疫应答建模的连续性研究，尤其适用于癌症疫苗开发。
- 企业级复用：该平台可适配多种mRNA（如GFP、卵清蛋白、肿瘤抗原），无需重新配方即可在多个项目中重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过提供一种特性明确、稳定的纳米颗粒系统，并具备已验证的转染效率，降低了mRNA递送机制的不确定性。
- 操作价值：制备过程简单（移液、涡旋混合）且可进行冻干处理，提高了实验室间的可重复性，减少了技术变异性。
- 战略价值：支持mRNA疫苗的快速原型开发，加快“推进/终止”决策进程，降低对无效候选分子的投资。
- 项目组合影响：通过生成抗原表达和树突状细胞成熟的早期有效性数据，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备核酸操作、纳米颗粒制备和流式细胞术方面的专业知识。
- 需要使用涡旋振荡器、恒温金属浴、冻干机、荧光显微镜和流式细胞仪。
- 不同团队间标准化操作需保持一致的聚合物:mRNA比例和孵育条件（25°C下孵育30分钟）。
- 针对不同mRNA的适应可能需要优化浓度和孵育时间，但不同转录本间的包封效率保持一致。
- 冻干工艺包括在-80°C下冷冻、初级干燥，以及在-20°C下储存，以防止再水化并维持纳米颗粒的完整性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:00
Polyplexes Formation, Lyophilization, and Resuspension
2:44
In Vitro Characterization
4:34
In Vitro Functionality Tests: Capacity to Activate Model Immune Cells by Using Ovalbumin as Antigenic Model mRNA
6:24
Results: Nanoparticle Synthesis and Physicochemical Characterization, mRNA Encapsulation Efficiency, and In Vitro Results
7:45
Conclusion
