使用 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像

该方法能够长期在活体小鼠双侧皮层区域记录并量化神经活动。双光子技术的优势在于可长时间同步检测大范围或分散的神经元群体的活动。该技术的应用拓展至对活体脑内不同区域特定神经元群体活动模式的研究。

在开始操作前12小时，将光学窗在70%乙醇中于50摄氏度下预热。光学窗由一个直径为5毫米的圆形顶部盖玻片和一个包含直径为3毫米圆形底部盖玻片的部分组成。完成预热孵育后，确认一只麻醉的、体重20至25克、年龄1个半至2个半的月大的Thy1 GCaMP6s小鼠对脚趾夹捏无反应，并为其眼睛涂抹眼膏。

将小鼠置于覆盖无菌手术巾的加热垫上，并使用小鼠头部固定装置以稳定头部。用双刃剃刀剃除大部分头皮毛发，随后依次使用无菌酒精棉片和聚维酮碘溶液擦拭清洁暴露的皮肤。然后使用剪刀在颅骨右侧的头皮上做一个2毫米×3毫米的矩形切口。

使用棉签将皮肤推开，形成一个直径大于三毫米的暴露区域，并用钝头显微外科刀片轻轻去除附着在颅骨上的结缔组织。使用牙科钻在 S1 区域周围轻轻标记一个直径为三毫米的圆圈。在颅骨左侧完成类似圆圈标记后，在骨面两侧均涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯超级胶水，以为后续涂抹牙科水泥提供基底。

在解剖显微镜下，使用高速微型钻头在颅骨右侧S1区域周围磨出一个环形沟槽，使边缘平滑，必要时用真空装置吸除骨屑。当钻至约三分之二骨厚度时，缓慢而仔细地继续减薄剩余三分之一的骨质，直至形成一个完全游离的环形骨瓣。使用5/45镊子缓慢而小心地移除该环形骨片，暴露硬脑膜，注意避免损伤软脑膜血管。

以相同方式去除颅骨左侧的骨瓣后，用无菌生理盐水冲洗右侧颅骨的光学窗口，并在体视显微镜下检查是否存在缺陷。将光学窗口安装至颅骨开窗区域，使窗口上部置于颅骨表面，下部位于颅骨开窗孔内， resting on the dura，在脑脊液存在的情况下完成安装。使用氰基丙烯酸酯超级胶水将光学窗口边缘的上部与颅骨密封固定。

胶水干燥后，将黑色牙科水泥涂抹在玻璃边缘、暴露颅骨右侧的其余部分以及伤口边缘，以阻隔光线。然后安装左侧光学窗口，并在密切监测下让动物恢复，直至完全恢复卧姿。手术后 7 至 10 天，将麻醉后的动物置于加热垫上的双光子显微镜头部固定适配器中，注意确保光学窗口和颅骨右侧与显微镜的光轴垂直。

使用四倍放大倍率的明场照明获取颅窗的初始参考图谱图像。在获取同一感兴趣区域的多张图像后，对左侧半球S1区域内的钙动力学进行成像，并计算颅骨两侧各感兴趣区域荧光强度的变化。在这些代表性图像中，于光学窗口植入后一天，在S1区域第二层的不同深度处观察到表达EGFP的小鼠的树突和一条血管。

在植入光学窗口后的第1天和第7天获取了Z轴投影图像，显示在实验期间树突分支和树突棘的数量与位置均保持显著稳定。通过测量Thy1 GCaMP6s转基因小鼠的细胞内钙瞬变，可对皮层第五层深度超过500微米以下的锥体神经元的自发钙活动进行定量分析，并计算随时间变化的平均自发反应次数。经过颅窗制备和活体双光子钙成像技术培训的研究人员，每天可在一至两只动物的颅骨两侧各记录到100至200个神经元。

通过在颅骨两侧建立开放的光学窗口，该方法可实现对称哺乳动物脑区神经活动的记录，从而在活体中进行长时间且稳定的钙成像。该方法还可用于研究外周或中枢神经系统单侧损伤后的皮层活动与可塑性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在 Thy1 GCaMP6s 转基因小鼠中安装双侧颅窗，以利用双光子显微镜测量钙动力学。