使用微尺度屏障组织平台（MicroSiM, µSiM）构建血脑屏障模型

我们正在开发一种血脑屏障的组织芯片模型，以研究脓毒症对大脑的影响以及血液中可溶性因子所起的作用。利用人诱导性多能干细胞，我们计划评估遗传因素对特定患者人群易感性的贡献。目前组织芯片领域面临的主要实验挑战是结果的可重复性以及外部实验室对相关技术的采纳。

独特的器官芯片设计、芯片内微小的体积以及缺乏标准化的功能检测方法，均加剧了这些挑战，往往使用户只能依赖基于荧光的检测作为主要读出手段。microSIM 装置提供了模块化设计，适用于多种体外建模需求，其类玻璃表面非常适合高分辨率成像，同时配备厚度仅为 100 纳米的超薄、高通透性纳米膜，确保可溶性因子的无缝串扰以及精确的通透性检测。通过使用 microSIM，我们发现特定类型的细胞倾向于产生更多基质蛋白，这些蛋白可在脑血管周围形成支撑性支架。

现在我们可以探究炎症是否会导致这些细胞增强或破坏其基质，从而改变屏障的完整性。未来，我们将在模型中增加另一个含有星形胶质细胞和小胶质细胞等绿色细胞的区室，以研究在脓毒症等全身性炎症情况下，这些细胞如何与血脑屏障相互作用。我们还计划进一步研究其他导致全身性炎症的原因，例如在痴呆基础上叠加的术后谵妄。

首先，将微SIM装置组装所需的所有材料放入生物安全柜中。使用芯片镊子将膜芯片放置在A1夹具的中心位置，芯片的平面朝下，沟槽区域朝上。倾斜带有芯片的夹具以显示沟槽处的反光。

使用直头镊子剥离组件一两侧的蓝色保护层，并将其放入夹具A1中，使上腔朝下。然后轻轻按压组件一，直至压敏胶（PSA）接触芯片。将夹具A2放置在夹具A1上，并在不同角落施加牢固压力，以确保芯片与组件一紧密贴合。

将组件二与芯片一起粘接到组件一上时，使用直头镊子夹住组件二的一个角，从片材上将其剥离。然后夹住组件二的非压敏胶区域或三角形区域，取下组件二的蓝色层，露出压敏胶表面。将组件二放置在夹具B1中，压敏胶面朝上。

然后将组件一与膜芯片一同放入夹具B1中，膜芯片的上腔室朝上。将夹具B2放置在组件一上，并在不同角落施加稳固压力。从夹具中取出组装好的装置，使用直头镊子密封通道边缘。

在用于细胞培养之前，使用紫外光对装置进行20分钟的灭菌处理。首先，将组装好的microSIM装置放入无菌的软管夹中，并置于大型无菌培养皿中进行培养。

为增加湿度，可放置一个装有无菌水的50毫升锥形管盖。为准备用于细胞培养的装置，用100微升水冲洗上层腔室。接着，通过混合胶原蛋白IV型、牛纤维连接蛋白和无菌水来配制包被溶液。

移除上层腔室中的水，并加入 100 微升包被溶液。将腔室在 37 摄氏度孵育 2 至 4 小时。孵育结束后，将上层腔室中的包被溶液替换为 100 微升室温 hECSR。

在底部腔室中加入 20 微升 hECSR 溶液。传代 EECM-BMEC 样细胞时，向细胞中加入细胞解离酶混合物，在 37 摄氏度孵育 5 至 8 分钟。接着，用移液器吹打细胞悬液，并将其加入到离心管中，再加入四倍体积的内皮细胞培养基。

在200 × g条件下离心5分钟，并将细胞重悬于1毫升hECSR中。将细胞以每平方厘米40,000个细胞的密度接种至顶室，在37°C孵育2至4小时以促进细胞贴壁。孵育结束后，更换上下两室的培养基为新鲜hECSR。

通过将 20 微升在 -20 摄氏度下预冷的 100% 甲醇加入到底部腔室，以及将 50 微升加入到顶部腔室来固定细胞。在室温下孵育装置 2 至 10 分钟。接着，通过向底部腔室加入 20 微升 PBS，向顶部腔室加入 100 微升 PBS 来洗涤细胞。

每次洗涤后，确认下室中无气泡。通过向下室加入 20 微升封闭液、向上室加入 50 微升封闭液，室温封闭 30 分钟。封闭结束后，将上室中的液体更换为 50 微升一抗溶液，室温孵育 1 小时。

用 PBS 洗涤后，向顶部小室中加入 50 微升二抗溶液，避光孵育一小时。PBS 洗涤后，向顶部小室中加入 50 微升 Hoechst 溶液，孵育三分钟。然后向底部小室中加入 20 微升 PBS，向顶部小室中加入 100 微升 PBS。

立即在共聚焦显微镜下对装置进行成像。使用湿式长工作距离40倍物镜定位膜窗，然后切换至荧光通道以检测Hoechst和连接蛋白染色情况。本实验展示了hiPSC细胞培养和接种密度不足的BPLC的最佳接种密度。

与原代共培养相比，源自hiPSC的共培养在相差成像中更容易区分。BPLC接种量过低会导致周细胞覆盖不全和成团，而接种过多则会导致周细胞层从膜上剥离。在免疫染色的hiPSC来源细胞共培养中，可见两层细胞紧密相邻，仅由一层薄的氮化硅纳米膜隔开。

在通透性检测中，培养两天的内皮细胞通透性表现出高度变异性，表明培养两天不足以实现屏障的成熟。此外，从第四天起屏障成熟后，各实验室之间的通透性无显著差异。