改进的人源细胞接触共培养血脑屏障模型的制备方法
2013年11月12日
建立人源血脑屏障（BBB）模型有助于研究与BBB功能障碍相关脑部疾病。本文介绍一种改良的接触式BBB模型制备技术，可在多孔膜的两侧分别共培养人源星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。
本实验旨在通过在多孔膜的两侧分别共培养星形胶质细胞和内皮细胞，以体外模拟血脑屏障。首先，用细胞外基质（如胶原蛋白）包被多孔膜的管腔面。将带有外部硅胶管和内部硅胶塞的倒置插件固定，使蛋白覆盖膜的非管腔面，从而在膜的非管腔侧形成一个可拆卸的培养小室。
现在将星形胶质细胞接种到倒置的插入式培养小室上，使其贴附在基底外侧表面。然后移除管路，将插入式培养小室恢复正常方向，放入含有培养基的孔中。接着将内皮细胞接种到插入式培养小室的管腔 compartment 中，并与相对的星形胶质细胞进行共培养。
最终，通过荧光示踪剂的通透性检测或跨内皮细胞电阻的记录，用于测量体外血脑屏障在不同刺激因子作用下的通透性变化。本实验操作将由我实验室的博士后 Barry Nigo 先生进行演示，他在攻读博士学位期间开发了这一改良的接种方案，并用于模拟血脑屏障。我们最初是在尝试了一些较为粗糙的接种方法后萌生了该实验思路，此前的方法常出现培养基从插件间隙泄漏以及培养液体积过小等问题，令人十分困扰。
这导致星形胶质细胞贴壁时间过短且不充分，我们正试图在实验步骤中解决这一问题。将组织培养小室放入24孔板的孔中。然后在每个小室内加入50 µL浓度为132 µg/mL的大鼠胶原蛋白，用于包被小室的腔面，于37 °C湿化培养箱中孵育过夜，以去除任何残留的酸，再用双蒸水清洗小室的腔面和基底面。
然后将插入物倒置，并在多孔膜边缘轻轻套上一段短的弹性硅胶管，基本上在基底外侧表面形成一个新的小室，以密封底部。
制备一个由硅胶管制成的塞子，其一端用0.2毫升PCR管的截断管尖密封。现在使用无菌镊子将硅胶塞插入管腔内，并推进至距离膜约一到两毫米处。接下来，在硅胶小室的基底膜表面上方，直接加入含有40,000个星形胶质细胞的200微升维持培养基。
为了监测星形胶质细胞的贴壁状态，使用标准的96孔板，因其具有与6.5毫米插入膜相同的表面积，并便于通过相差显微镜观察细胞。将相同体积的星形胶质细胞悬液接种到96孔板中，共八个孔。通过随时间观察，以确定星形胶质细胞在96孔板中以及相应插入膜上是否已充分贴壁，从而维持无菌状态。
将组装好的插入式培养板置于两个六孔板之间进行转运，以尽量减少暴露于未过滤空气中。将细胞放入培养箱中，使星形胶质细胞贴壁。同时将对照96孔板也放入培养箱中。
约四小时后，检查对照 96 孔板，观察星形胶质细胞是否已贴壁。若已贴壁，则将插入式装置重新转移回组织培养操作台。轻柔地移除外置硅胶管和塞子。
然后将插入物放回正常直立方向，置于含有每孔800 µL内皮细胞维持培养基的孔中。在BEC培养基中，将20,000个脑微血管内皮细胞以每孔200 µL接种到胶原蛋白包被的管腔侧共培养表面，共培养三天，期间不更换任何培养基。实验前进行。
将硅胶管和塞子在使用前用乙醇清洗，然后进行高压灭菌以备后续使用。为了刺激体外血脑屏障，首先分别用 600 微升和 100 微升无血清 BECS 培养基替换基底侧和管腔侧的培养基。吸除管腔侧洗涤液，并加入含刺激因子的 100 微升无血清培养基。
若从星形胶质细胞区室诱导体外血脑屏障（BBB），则吸除基底侧培养基，并替换为600 µL无血清培养基，其中含有刺激因子。随后继续进行标准的旁细胞或跨细胞通透性检测，使用标记示踪剂以建立人源接触型血脑屏障模型。永生化的人源星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞被共同培养在孔径为3 µm的多孔膜上，该膜允许星形胶质细胞突起及其足板穿过并与内皮细胞直接接触。
该方法为星形胶质细胞和BECs提供了最佳的连续接种期，使这两种细胞能够牢固地附着在多孔表面，细胞损失极小，并在三天内生长至汇合。接种后，两种细胞类型均能在多孔膜上维持其细胞特异性标志物，这通过SVG细胞中胶质纤维酸性蛋白GFAP和NEC细胞中von Willebrand因子VWF的表达模式得以证实。
与接触性血脑屏障（BBB）模型最基本的特征一致，星形胶质细胞的终足（NFE）能够穿过三微米的孔进入管腔室。因此，直径为该尺寸的孔上可能同时存在突触小体（SVGs）和基底外侧表面（BES）之间的接触。此外，扫描电镜（SEM）成像表明，SVGs和脑微血管内皮细胞（BBCs）能够在膜孔上方直接生长，这一现象会人为地增强体外BBB接触模型的物理屏障功能。
本研究采用人源性接触型血脑屏障（BBB）模型，探讨TPA溶栓剂对血脑屏障的影响。这些体外实验结果证实，TPA确实以浓度和时间依赖性的方式增加了完整血脑屏障的通透性，且浓度和时间均处于药理学相关范围内。暴露于TPA后，SVG星形胶质细胞在多孔膜上表现出显著的形态学改变，提示星形胶质细胞对TPA的反应是TPA诱导血脑屏障开放的基础。
该方法在我们的研究中发挥了关键作用，旨在探究血脑屏障对用于中风患者溶栓治疗的 TPAA 溶栓药物的反应。这是文献中首次报道该方法的应用，我们希望其他研究人员能够将其采纳并用于各自的研究目的。
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概述
本文介绍了一种通过共培养星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞来建立人源血脑屏障（BBB）模型的改进技术。该方法可增强对BBB生理环境的模拟，有助于更深入地研究与血脑屏障功能障碍相关的脑部疾病。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物医学工程
背景
- 血脑屏障对于维持大脑稳态至关重要。
- 血脑屏障功能障碍与多种神经系统疾病相关。
- 现有模型通常缺乏准确模拟所需的复杂性。
- 改进的模型有助于理解血脑屏障通透性及药物递送机制。
研究目的
- 建立可靠的血脑屏障体外模型。
- 促进在不同条件下对血脑屏障通透性的研究。
- 探讨药理学药物对血脑屏障完整性的效应。
使用的方法
- 在多孔膜上共培养人星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。
- 使用细胞外基质蛋白以增强细胞黏附。
- 利用荧光示踪剂测量通透性变化。
- 检测细胞特异性标志物以确认共培养成功。
主要结果
- 改进的接种方案实现了细胞的最佳贴附和生长。
- 两种细胞类型均保持了其特异性标志物，表明共培养成功。
- 暴露于TPA后，血脑屏障通透性随浓度增加而升高。
- 扫描电镜成像显示细胞直接在膜孔上生长，增强了屏障功能。
结论
- 该模型能够有效模拟人类血脑屏障（BBB）。
- 可用于研究各种物质对血脑屏障通透性的影响。
- 本研究有助于深入理解与血脑屏障相关的病理机制。
常见问题
行业重要性概述
稳健的体外血脑屏障（BBB）模型对于中枢神经系统（CNS）药物早期发现至关重要，可实现对化合物通透性的预测性评估以及作用机制相关的风险排除。这种改进的人源细胞接触型血脑屏障模型克服了在可重复性和通量方面的技术障碍，支持神经治疗项目的转化研究和候选药物组合筛选。其标准化的操作流程提高了对血脑屏障调控及化合物转运进行临床前评价的可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可揭示与中枢神经系统靶点验证相关的血脑屏障通透性机制。
- 通过模拟人源特异性血脑屏障对药理学物质的反应，支持生物学层面的风险评估。
- 有助于提高化合物选择用于穿透中枢神经系统时的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 提供一种可重复、高通量的平台，用于筛选化合物对血脑屏障完整性的效应。
- 利用荧光示踪剂和电阻测量方法，标准化定量通透性检测。
- 支持对化合物诱导的血脑屏障调控进行可靠评估，以用于后续工作流程。
转化与临床前研究
- 将体外血脑屏障（BBB）反应与神经系统疾病中相关的致病机制相一致。
- 支持从发现到靶向血脑屏障干预措施的临床前验证的连续性研究。
- 通过模拟人类细胞相互作用和屏障功能，降低转化医学风险。
流程与工作流整合
该接触式血脑屏障模型适用于从早期发现到临床前研究的连续过程，可连接靶点验证、化合物筛选以及血脑屏障调节机制的研究。
- 发现生物学：可在受控条件下进行血脑屏障通透性及细胞相互作用的假设验证。
- 筛选：提供标准化、定量的输出结果，用于化合物初筛及检测方法的可重复性评估。
- 分析：提供通透性和电阻测量数据，用于比较不同实验条件及药物作用效果。
- 转化研究：促进体外研究结果与血脑屏障功能障碍的临床前模型之间的对接。
- 企业级应用：提供可扩展、可重复使用的平台，满足多样化的血脑屏障相关研究与筛选需求。
运营与企业影响
- 科学价值：提高对中枢神经系统项目血脑屏障通透性和靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：提升血脑屏障检测方法的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：支持基于数据的立项/终止决策，降低神经治疗药物在后期开发中的生物学风险。
- 项目组合影响：基于与人体相关的血脑屏障数据，实现对中枢神经系统候选药物的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备人源细胞培养及共培养技术的专业知识。
- 需要获取专用的插入式培养小室、细胞外基质包被材料以及用于通透性检测的分析仪器。
- 要求跨团队在细胞来源、接种方法和检测方案方面实现标准化。
- 针对不同细胞类型或与疾病相关的修饰，可能需要进行方法优化与调整。
- 局限性包括静态（无流动）培养条件以及依赖永生化星形胶质细胞系。
