利用电穿孔递送Cas9-sgRNA复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

本实验室研究结核分枝杆菌与宿主免疫系统之间的相互作用，重点关注细菌与巨噬细胞之间的初始相互作用。在巨噬细胞中已采用多种基因敲除技术，包括RNA干扰技术与CRISPR技术。其中主要挑战之一在于巨噬细胞中基因敲除效率较低。

本方案能够实现对原代巨噬细胞进行快速且高效的遗传操作，无需进行克隆和质粒构建。这些方法在免疫学研究中具有广泛适用性，可使研究人员在原代巨噬细胞中敲除基因，用于多种多样的研究。首先，将放置在超净工作台中的移液工作站参数设置为1,900伏、20毫秒，单次电脉冲。

小心地从包装中取出一支转染管，以保持其无菌状态，并加入 3 毫升 E 缓冲液。为准备电穿孔，从细胞中移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞，以去除促进贴壁的血清和二价阳离子。随后，向细胞中加入 PBS 与 1 毫摩尔 EDTA 的混合液，在室温下孵育约 5 分钟，直至细胞开始脱落。

轻轻吹打混匀以悬浮细胞，并将细胞转移至一个低蛋白结合力的15毫升离心管中。在500 ×g下离心5分钟，使细胞沉淀。离心后迅速移除大部分上清液，保留约1毫升上清液在管中。

将细胞重悬于剩余的上清液中，并转移至低蛋白吸附的1.5毫升微量离心管中。取少量细胞样品用于计数，其余细胞在室温下以500×g离心5分钟，收集细胞沉淀。在离心过程中进行细胞计数。

取1× sgRNA和20毫摩尔的Cas9溶液，将管子 warming 至室温。离心后，移除细胞沉淀中的全部上清液，并用含有氯化钙和氯化镁的PBS重悬细胞，细胞浓度为每毫升4000万个。对于sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物的组装，将2.5微升sgRNA加入含1微升稀释Cas9的无菌PCR管中，边缓慢加入sgRNA边混匀约15秒，以防止沉淀产生。

室温孵育5分钟，以促进核糖核蛋白复合物的形成。通过电穿孔递送核糖核蛋白复合物时，先按下电穿孔枪头的推杆以伸出杆部，然后将杆部插入枪头中。

通过上下吹打重悬细胞。用细胞悬液充满电穿孔尖端，并吸取尖端全部10微升体积容量。从阴性对照sgRNA开始，将电穿孔尖端中的10微升细胞转移至含有3.5微升核糖核蛋白的样品管中。

上下吹打三次以充分混匀，并将10微升混合液重新吸入枪头中。将枪头放入电穿孔仪的电转站，插入缓冲液中，然后按下触摸屏显示器上的“开始”按钮。电转完成后，显示器将提示电击脉冲成功。

从仪器上取下移液器，将细胞放入未包被的12孔板的干燥孔中。用含有氯化钙和氯化镁的15毫升PBS溶液，上下吹打两次以冲洗枪头。将仍连接着枪头的移液器放置一旁备用。

立即将之前分装好的1毫升不含抗生素的培养基加入细胞中，并轻轻摇动培养板以混匀。此处展示的是用对照性非靶向sgRNA、Cas9核糖核蛋白复合物、靶向Rosa 26位点的sgRNA以及Src和Cblb基因进行电穿孔修饰后，从小鼠骨髓来源巨噬细胞中获得的Rosa 26位点的代表性Sanger测序色谱图。通过PCR和Sanger测序对靶基因进行分析，结果显示在Cas9切割位点下游的每个位置均出现多个核苷酸。

这些结果验证了多个靶向基因均达到了高编辑效率。