活酵母细胞中线粒体过氧化氢比率型生物传感器 mtHyPer7 的成像

线粒体是细胞内的细胞器，参与能量动员、中心代谢、重要大分子的合成、钙离子储存以及信号转导。因此，线粒体在细胞功能、细胞适应性及寿命调控中发挥着关键作用。我们的研究聚焦于利用出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模式生物，探究线粒体对衰老过程的影响。

活细胞成像技术是我们观察线粒体功能变异的最佳工具。本文介绍一种利用基因编码的、具有比率检测特性的光谱转移生物传感器——线粒体型HyPer 7（mtHyPer 7）的方法。mtHyPer 7可检测过氧化氢，后者是一种活性氧，既可能损伤细胞组分，也可在活细胞线粒体中作为信号分子发挥作用。

MtHyPer 7 对过氧化氢具有高亲和力，且对 pH 值的敏感性较低。它被整合到酵母基因组中，可在酵母细胞群体中实现稳定且一致的表达。最后，它可被定量靶向至线粒体，且对细胞或线粒体的功能及适应性无明显影响。

像 mtHyPer 7 这样的生物传感器对于在亚细胞分辨率下研究线粒体功能、发现线粒体质量控制背后的机制，以及探究该过程如何影响细胞适应性、命运和寿命至关重要。与用于活性氧检测的有机染料相比，mtHyPer 7 能够提供稳定的标记。相较于基于 FRET 的传感器，mtHyPer 7 更为紧凑，并避免了FRET所存在的问题，例如激发光串扰、信号渗漏，以及对供体与受体精确位置和取向的要求。

首先，取1 mL表达线粒体靶向HyPer 7的对数中期芽殖酵母细胞培养液。在6,000 G离心30秒，弃去上清液，管中保留10至20微升。使用微量移液器轻轻吹打残留培养基，重悬细胞沉淀。

接下来，使用气吹或无绒布清洁载玻片，并在载玻片上加入1.8 µL细胞悬液。最后，将1.5号盖玻片以倾斜角度缓慢盖上，避免产生气泡。然后将载玻片置于显微镜载物台上。

为了成像细胞，需设置采集参数，以确保每个荧光通道均具有可检测的信号和可接受的分辨率。例如，在配备 sCMOS 相机的转盘共聚焦显微镜上，可使用 2×2 像素合并，激光功率为 20% 至 40%，曝光时间为 200 至 600 毫秒。接着，检查图像的直方图。

在12位图像中，确保像素值的总动态范围至少达到数百个灰度级，且未出现饱和。此外，该范围应比噪声水平高一个数量级。为计算噪声水平，需测量图像中无细胞区域像素值的标准差。

然后在无时间间隔的情况下连续采集延时图像，以评估成像条件对线粒体信号稳定性和氧化应激的影响。使用显微镜采集软件或 ImageJ 测量每个荧光通道的平均像素值，以确保信号稳定。如果实验不涉及延时成像，则需确保在两到三次重复采集的 Z 层扫描中荧光信号保持稳定。

对于出芽酵母，以0.5微米的Z轴间隔和总共六微米的Z轴堆栈深度采集图像。若采集Z轴堆栈图像，需确保数据集中所有图像的Z轴间隔相同，并包含完整的细胞。同时，采集透射光图像以记录细胞边界。

首先，在 Fiji 中打开一个多通道 Z 层图像，并打开所需的生物传感器分析脚本文件。在脚本编辑器窗口中点击“运行”以执行脚本，然后在弹出的对话框中输入所需信息。

选择用于比率计算的分子和分母对应的通道编号。对于线粒体靶向的 HyPer 7，分子为在 488 纳米激发的通道，分母为在 405 纳米激发的通道。如果存在透射光图像，请选择其通道编号；若无透射光图像，则选择 0。

然后选择所需的背景扣除方法。如果背景均匀，单击“选择图像区域”以测量图像中的背景水平。随后，选择所需的噪声扣除方法，以减少检测器读出中的随机波动。

单击“选择图像区域”。选择“固定值”选项以输入先前测得的噪声水平，如果成像条件保持恒定，此方法通常效果良好。为了准确且一致地检测线粒体，请选择一种阈值分割算法，例如 O2 或最大熵算法。

对实验中的所有图像使用相同的算法，但需确保准确识别线粒体。然后选择每个细胞的感兴趣区域数量。例如，若测量母细胞与芽细胞的差异，则选择两个。

选择用于保存测量结果和比率图像的输出文件夹。如需进行背景或噪声校正，请选择“选择图像区域”，然后根据提示使用矩形 ROI 工具绘制背景区域，再点击“确定”。在分析单个细胞或亚细胞区域时，应基于明场图像绘制感兴趣区域。

ROI 无需精确匹配细胞轮廓，因为仅会测量 ROI 内经过阈值处理的线粒体。创建每个 ROI 后，按 T 键将选定的 ROI 添加到 ROI 管理器中。在 ROI 管理器中勾选“显示全部”，以记录已标记的细胞。

每个添加的区域将以编号项的形式显示在ROI管理器列表中。若对每个细胞分析多个ROI，请对所有待分析细胞以相同的顺序标记ROI。当所有目标ROI均添加至ROI管理器后，单击“标记细胞”对话框中的“确定”按钮。

接下来，选择测量表格式。在多测量对话框窗口中，勾选“测量所有切片”和“每个切片对应一行”选项，以生成所需格式的表格。使用 ProcessMultiROITables。

用于处理使用“每切片一行”选项创建的表格的 R 脚本。请勿勾选“追加结果”选项。使用该脚本将输出文件保存到所选文件夹中。

现在在 Fiji 中打开比率 Z-栈图像，以生成彩色的比率图像。然后打开 colorize_ratio_image.ijm 脚本文件，在脚本编辑器窗口中点击运行。

将弹出一个对话框，提示输入所需信息。在“未调制”选项中，所有线粒体像素均以相同的亮度显示。由于暗像素和亮像素均会对比值图像产生影响，某些图像可能看起来存在噪声。

使用强度调制选项以降低噪声。在最小值和最大值显示方法中，选择接近实验中观察到的平均最小值和最大值的数值。为确保一致性，应使用相同的成像条件采集所有图像，并使用相同的最小值和最大值显示所有图像。

然后选择投影模式以投影Z轴层叠图像，并在着色前显示完整的线粒体群体。若要生成最大强度投影，请选择“Maximum”；若要生成平均强度投影，请选择“Average”。

最后，选择用于保存着色图像的文件夹。如果选择了“未调制”选项，请在出现的对话框中选择一种配色方案。可使用 Fiji 内置的 Fire 或 Rainbow RGB 查找表，或其他任何以 ImageJ 的 LUT 格式提供的所需查找表。

使用该脚本将输出文件保存至所选文件夹。线粒体标记的 HyPer 7 的氧化还原比对外源添加的过氧化氢浓度呈剂量依赖性响应，在外源添加的过氧化氢浓度达到 1 至 2 毫摩尔时达到平台期。在酵母细胞内观察到线粒体过氧化氢水平的差异。

与母细胞相比，在芽中的线粒体检测到过氧化氢生物传感器信号显著降低。