活细胞中利用比率型双分子信标对单个工程化RNA转录本进行实时成像

本实验的总体目标是实时成像活细胞中的单个RNA转录本。首先，通过杂交两个寡核苷酸，形成一种称为分子信标比率探针的发夹结构探针来实现这一目标。第二步是通过尺寸排阻色谱法纯化该分子信标比率探针。

接下来，通过显微注射将分子信标的比例检测指标导入表达工程化RNA靶标的细胞中。最后一步是将细胞置入适合活细胞显微成像的微孔板中。最终，利用荧光显微镜监测单个细胞内呈现为明亮荧光斑点的单个RNA转录本的动态行为。

该技术的主要优势在于使用了亮度高、光稳定性好且信噪比较高的合成探针，从而为成像任何内源性RNA提供了可能。开始配制比例型分子信标（RBM BS）时，需在试管中混合以下试剂：20微升Rbm B1、30微升Rbm B2、6微升10×磷酸盐缓冲液以及4微升无DNA和RNA的水。该混合液通常足以进行约50次实验。

将混合物在室温下孵育30分钟。在此期间，准备一根液相色谱柱，用于去除任何未杂交的UN RBM B二聚寡核苷酸。使用75根制备级super decks，装入一个8毫升的液相色谱柱中，床体积约为4毫升，采用注射泵以0.6毫升/分钟的流速进行操作。

在所有液体进入柱床体积之前，用约50毫升1×磷酸盐缓冲液洗涤并平衡SUEx。停止注射泵，将其取下，让剩余液体依靠重力流过层析柱。接着，将RBMB混合物上样到层析柱中。

待RBMB样品完全进入层析柱后，缓慢向柱床上端加入另外250 µL的1×磷酸盐缓冲液，以确保整个样品完全进入柱中。用1×磷酸盐缓冲液将柱体填充至边缘。关闭柱顶，启动注射泵。

将注射器装入约50毫升的1×PBS，以0.6毫升/分钟的流速运行。通常情况下，由于探针中掺入了染料，RBMB样品可被清晰观察到。当RBMB接近层析柱底部时，每两滴收集至一个微量离心管中。

停止收集样品。当微量离心管中的样品颜色变为澄清后，合并含有着色 RBMB 样品的管子，通常为五到六管，并转移至离心过滤装置中。在 10,000 RCF 条件下离心 20 分钟，或直至达到所需体积。

此速度和时间通常会产生约30微升的终体积。在本实验方案中，一个人类纤维肉瘤细胞系经过基因改造，可在其3'非翻译区（UTR）表达含有96个串联重复RBMB靶序列的Q-F-P-R-N-A；对照细胞系则被改造为在探针递送前一天表达野生型Q-F-P-R-N-A，细胞培养于T25培养瓶中，汇合度为40%至50%。细胞使用添加了1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养至次日。

开启微孔仪，并设置适用于 HT1080 细胞的微孔处理参数。将 4 毫升电泳缓冲液加入微孔处理管中，并将其放置于微孔制备工作站上。解冻一份纯化的 RBMB 储存样品，取数微升用 1× 磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为 12 微摩尔。

每个微穿孔反应需要一微升。每个微穿孔反应中，用移液器吸取一毫升含FBS但不含抗生素的培养基至微量离心管中。将其放置在微穿孔装置附近备用。

稍后将在显微操作制备后立即用于悬浮细胞。不使用抗生素，因为它们会降低显微操作制备后细胞的存活率。前一天接种的经基因改造的 HT 1080 细胞目前应达到 60% 至 80% 汇合度。

吸去细胞培养基，用一毫升不含钙和镁的 DPBS 洗涤细胞一次，加入一毫升胰蛋白酶孵育一至两分钟。加入一毫升含 10% 胎牛血清（不含抗生素和酚红）的 DMEM 培养基以终止胰蛋白酶消化反应，并将细胞转移至两个 1.5 毫升微量离心管中。在微量离心机中以 200 × g 离心五分钟，沉淀细胞。

弃去上清液，用终体积为1毫升的DPBS重悬并合并细胞沉淀。从充分混匀的细胞悬液中取出10微升进行细胞计数，反复吹打混匀数次以确保细胞充分分散，然后将300,000个细胞用DPBS转移至新的1.5毫升微量离心管中。以200 × g离心5分钟。

移除上清液时需小心，避免扰动细胞沉淀。将沉淀重悬于11 µL重悬缓冲液中，并用移液器反复吹打数次，以确保细胞充分分散。注意避免产生气泡。

加入一微升稀释后的 RBMB，并通过反复吹打数次充分混匀。同样，务必注意不要产生任何气泡。避免将气泡引入 RBMB 悬浮液至关重要，因为气泡会在显微操作过程中引发火花，导致 RBMB 递送效果不佳和细胞死亡。

使用微量移液器吸取10微升RBMB细胞混合液，并将移液器插入微制备管中。按下启动按钮以开始微制备过程。当微孔仪屏幕显示完成时，枪头中应无可见气泡。

从移液工作站上取下移液器，将10 µL混合物排入先前准备好的微量离心管中，该离心管内含有1 mL添加了FBS但不含抗生素的培养基，通过左右轻轻摇动管子数次使其充分混匀。以200 × g离心5分钟。用1 mL不含酚红、含有FBS但不含抗生素的培养基洗涤细胞两次，以去除未进入细胞的rbm BS。

第二次洗涤后，将细胞重悬于400微升不含抗生素但含FBS的酚红-free培养基中。每孔加入200微升或按所需汇合度，将微量化细胞接种至预先制备的多聚赖氨酸包被的八孔腔室盖玻片中。

将带腔室的盖玻片放入细胞培养孵育箱中。微制备后30分钟即可开始成像。开始此操作前，需打开活细胞载台孵育系统，并使其平衡至37摄氏度、5%二氧化碳和75%湿度。

打开显微镜和荧光光源，启动Metamorph图像采集软件。在物镜上滴加镜油。将带有微孔细胞的腔室盖玻片转移至活细胞载物台。

顶部培养系统。将载物台培养系统孵育至温度和二氧化碳水平稳定。在 MetaMorph 软件中打开采集选项卡。

单击“显示实时”按钮以找到视野。在白光下调节焦距，然后在“采集”选项卡下单击“停止实时”按钮。

单击并打开视频采集弹出按钮，设置所需的视频采集参数。使用SCI五号CF六号40R滤镜采集150帧图像。将图像保存至硬盘。

图中显示的是稳定表达含有96个串联重复序列或三个末端非翻译区（3' UTR）中RBMB结合位点的4个串联重复序列RNA的HT 1080细胞的代表性图像。在将mbs递送入细胞内后，由于存在96个串联重复序列，单个RNA转录本可呈现为明亮的荧光点。

相比之下，仅包含四个串联重复序列的RNA表现为非常微弱的荧光点，通常只能在背景信号极低的区域检测到。连续成像的采集使得单个RNA转录本能够被实时观察。单个RNA转录本可清晰地在细胞质和细胞核内观察到，并呈现布朗运动或亚扩散运动。

在极少数情况下，可观察到正在进行定向转运的 RNA，如此处所示。正在进行定向转运的 RNA 转录本通常沿直线快速移动。在此图像拼合图中，RNA 转录本的运动轨迹叠加显示于时间序列的单帧图像之上。

定向的RNA运动与RNA沿微管和微丝的运输一致。观看本视频后，您应充分了解如何利用分子信标制备和纯化racial metric。通过微注射将分子信标介导的racial metric递送至细胞，并利用荧光显微镜对单个RNA转录本进行成像。