玻璃体和房水标本游离DNA提取用于玻璃体视网膜淋巴瘤的诊断与监测

本研究旨在通过玻璃体切除术采集眼内玻璃体液，并利用分子检测方法诊断玻璃体视网膜淋巴瘤（VRL）。VRL 是一种侵袭性强的疾病，其症状与常见的眼部炎症性疾病相似。目前用于诊断 VRL 的方法包括细胞病理学、流式细胞术和分子检测。已有文献报道，非分子检测方法的敏感性分别为：细胞病理学 44% 至 90%，流式细胞术 50% 至 60%。

细胞病理学、流式细胞术以及基于细胞DNA的分子检测均需要完整的肿瘤细胞。这在玻璃体液标本中构成了难题，因为此类标本的体积小、细胞含量低，且细胞可能因凋亡以及标本采集、处理和储存过程而发生降解。我们发现，从玻璃体液标本中提取的无细胞DNA可作为分子检测的另一种DNA来源，其无需依赖完整细胞，且同样能够提供眼内淋巴瘤（VRL）存在的证据，可用于该型淋巴瘤的诊断。

游离细胞DNA提取技术可在缺乏完整肿瘤细胞的情况下实现分子检测。该方法能够最大限度地利用玻璃体样本，将完整的细胞保留用于细胞病理学和流式细胞术分析，同时利用原本会被丢弃的上清液进行分子检测。首先，用三至五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）稀释黏稠的玻璃体液，以方便移液操作。

将收集在盒式袋中的稀释玻璃体液转移至50毫升离心管中。对于低体积的房水样本，先将样本转移至1.5毫升离心管中，然后用等体积的PBS冲洗原始的500微升微量离心管，并将冲洗液一并加入1.5毫升离心管中。

最后，在室温下以 3,000 G 离心玻璃体液 15 分钟。然后小心吸取上清液至新离心管中，注意不要扰动细胞沉淀。进行 DNA 提取时，首先向从眼内液获得的细胞沉淀中加入适量的细胞裂解液。

用移液器反复吹打溶液以充分混匀。待细胞完全裂解后，加入蛋白沉淀溶液，使其终体积占总体积的1/3。随后涡旋剧烈振荡20至30秒。

然后在室温下以 3,000 G 离心 3 分钟。同时，将 300 微升异丙醇转移至一个干净的微量离心管中。离心完成后，小心地将上清液用移液器转移至含有异丙醇的离心管中。

接下来，向离心管中加入 1.5 µL 甘油，倒置离心管以充分混匀。将离心管置于 -20 °C 冰箱中孵育 1 小时或过夜，以促进 DNA 沉淀。冷冻结束后，在室温下以 3,000 ×g 离心 5 分钟。

然后用移液器吸出异丙醇。为洗涤沉淀，加入0.5毫升70%乙醇。轻轻倒置离心管，以确保充分均匀洗涤。

然后在室温下以 3,000 G 离心 1 分钟。弃去离心管中的上清液。将离心管倒置于干净的纱布上，沥干溶液并干燥沉淀物。

在微型离心机中短暂离心后，使用细尖的一次性移液枪头吸除残留的乙醇液滴。接着，向干燥的DNA沉淀中加入45 µL DNA水化溶液。然后将离心管置于设定为50 °C的加热金属块中。

眼内液体的细胞组分和无细胞组分的DNA得率相似。对与玻璃体视网膜淋巴瘤相关的突变，分别在细胞组分和无细胞组分中进行了PCR分析。无细胞组分显示出更高的突变率，表现为循环阈值降低。

首先，每毫升眼液的无细胞上清部分加入 70 微升预处理缓冲液。涡旋振荡澄清珠以充分混匀。接着，将珠子加入样品中。

然后涡旋震荡样品与磁珠混合物。在室温下以 3,000 G 离心 15 分钟。勿扰动沉淀，小心吸出上清液。

然后向沉淀中加入等体积的尿液沉淀消化缓冲液。用移液器吹打溶液，使沉淀重新悬浮。接着将蛋白酶K加入重新悬浮的沉淀混合物中。

将混合物在 55 摄氏度下孵育 30 分钟。然后向消化混合物中加入等体积的基因组裂解缓冲液。充分涡旋振荡溶液以混匀。

现在将市售的离心柱放入一个新的收集管中。向离心柱中加入200 µL尿液DNA提取缓冲液。在室温下以16,000 ×g离心1分钟，并弃去滤过液。

现在将700微升尿液DNA洗涤缓冲液加入柱中，按所示方法离心。弃去穿流液后，将离心柱转移至无DNA酶和RNA酶的微量离心管中。最后，直接向柱基质中加入适量的DNA洗脱缓冲液，在室温下静置3至5分钟，然后再次离心以获得无细胞DNA。

眼内液体的细胞组分和无细胞组分所提取的DNA产量相似。对与玻璃体视网膜淋巴瘤相关的突变，分别在细胞组分和无细胞组分中进行了PCR分析。无细胞组分中的突变率更高，表现为循环阈值降低。